江蘇省實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染情況調(diào)查研究

宋鴻雁，朱順星，劉 春，邵義祥

（南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 江蘇省開放性動物實(shí)驗(yàn)中心，江蘇南通226001）

家兔是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動物，在免疫學(xué)研究、藥物研究、人類疾病模型等多個研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。近年來，我國十分重視實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)的發(fā)展，逐步建立和完善了實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)測體系，包括實(shí)驗(yàn)兔在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量有了很大提高。然而，兔病仍是影響實(shí)驗(yàn)兔健康的巨大威脅。兔球蟲病是家兔最常見的危害最嚴(yán)重的疾病之一，是一類由艾美耳屬（Eimeria）的球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的寄生性原蟲病，流行非常普遍，世界各地均有發(fā)生。家兔球蟲病在臨床上以腹瀉、生長緩慢、消瘦為主要特征，引起較高的發(fā)病率和死亡率，幼兔感染率高達(dá)90%以上，病死率高達(dá)40%～70%［1］。

多年來，國內(nèi)外學(xué)者對兔球蟲病進(jìn)行了相關(guān)研究［2-5］，但目前，對兔球蟲病研究的廣度和深度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于禽球蟲病。僅有的一些流行病學(xué)資料也主要集中于對生產(chǎn)型兔場或散養(yǎng)兔的報(bào)道，報(bào)道顯示目前國內(nèi)兔球蟲感染非常普遍［6-10］。相對于商業(yè)用兔，實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染情況的調(diào)查資料更加匱乏，周智君等［11］對湖南省部分地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔寄生蟲病的情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)兔球蟲檢出率為100%，這一結(jié)果令人不安。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量直接影響科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)論及生物制品的質(zhì)量，越來越受到關(guān)注和重視，在現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中球蟲被列為實(shí)驗(yàn)兔應(yīng)排除（除普通級外）的寄生蟲之一［12］。江蘇省聚集了多所高等院校、科研單位及制藥企業(yè)，近年來實(shí)驗(yàn)兔用量大幅度增加，據(jù)了解，僅江蘇省蘇北地區(qū)某養(yǎng)殖公司年出欄科研、生物制藥用實(shí)驗(yàn)兔達(dá)200余萬只。但是，關(guān)于江蘇省實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染情況的調(diào)查研究尚未見報(bào)道，本研究開展了江蘇省蘇北、蘇中、蘇南和南京地區(qū)主要實(shí)驗(yàn)兔供應(yīng)基地的實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染情況的調(diào)查，為確保高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動物，保證科學(xué)實(shí)驗(yàn)順利開展，對實(shí)驗(yàn)兔的球蟲感染情況進(jìn)行系統(tǒng)、全面的調(diào)查研究具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 飽和食鹽水溶液，25g／L重鉻酸鉀。1.1.2 主要儀器設(shè)備 光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX41），麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板，40目、60目、80目和100目銅篩，電子天平，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 以江蘇省蘇北、蘇中、蘇南及南京地區(qū)的4個實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖供應(yīng)基地為調(diào)查對象，按照4個不同的地點(diǎn)編號為1、2、3、4，每個采樣點(diǎn)隨機(jī)采集15份新鮮糞樣，每個糞樣20g左右，將糞樣放入預(yù)先編號的采樣袋內(nèi)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，放入4℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品卵囊檢查 用飽和鹽水漂浮法和Mc-Master′s法，逐份檢查感染情況和感染強(qiáng)度，并計(jì)算出感染率和克糞便卵囊數(shù)（OPG）。

1.2.3 卵囊的收集與培養(yǎng) 采用飽和鹽水漂浮法收集球蟲卵囊，將糞樣加清水浸泡、搗碎，分別用40、60、80、100目銅篩過濾，將濾液以轉(zhuǎn)速3 000 r／min，離心10min，取沉淀加飽和鹽水混勻，靜置30min，以轉(zhuǎn)速3 000r／min，離心10min，取上清加5倍體積的水，再離心洗滌1次，收集沉淀，即為球蟲卵囊。將離心收集的球蟲卵囊加入25g／L的重鉻酸鉀，混勻，移至平皿中28℃恒溫培養(yǎng)，每天吹打1次～2次，直到85%的卵囊孢子化為止，收集培養(yǎng)的球蟲卵囊，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蟲種鑒定 顯微鏡下隨機(jī)觀察每個糞樣50個卵囊，對卵囊進(jìn)行拍照，用Sharp Capture軟件測定卵囊大小、計(jì)算形狀指數(shù)，并觀察卵囊形態(tài)特征、顏色、卵膜孔的有無、內(nèi)外殘?bào)w的有無等，根據(jù)卵囊特征，參照文獻(xiàn)［1，13］進(jìn)行蟲種鑒別，計(jì)算出每種卵囊所占的百分比。

2 結(jié)果

2.1 江蘇地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染率和感染強(qiáng)度

本試驗(yàn)共調(diào)查了江蘇地區(qū)4個實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖供應(yīng)基地的兔糞樣60份，糞樣檢查發(fā)現(xiàn)，4個基地實(shí)驗(yàn)兔感染率為100%。蘇北地區(qū)的實(shí)驗(yàn)兔球蟲OPG值最高，南京地區(qū)最低（表1）。

表1 江蘇地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔球蟲感染率和感染強(qiáng)度Table 1 The infection rate and intensity of coccidia in experimental rabbits in Jiangsu province

2.2 各球蟲種類及檢出率

從調(diào)查、鑒定結(jié)果來看，此次江蘇地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔共檢出10種兔艾美耳屬球蟲，分別是斯氏艾美耳球蟲、穿孔艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、梨型艾美耳球蟲、無殘艾美耳球蟲、盲腸艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、小型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲，且全部為混合感染（圖1）。最常見的球蟲是穿孔艾美耳球蟲，所占比例為27.97%，其次為無殘艾美耳球蟲，比例為15.08%，再次為腸艾美耳球蟲，比例為11.47%。其中蘇北地區(qū)優(yōu)勢種為無殘艾美耳球蟲（33.71%），蘇中地區(qū)優(yōu)勢種為腸艾美耳球蟲（23.88%），蘇南地區(qū)和南京地區(qū)和優(yōu)勢種均為穿孔艾美耳球蟲（48.77%、37.23%）（表2）。

圖1 江蘇省10種艾美耳球蟲孢子化卵囊形態(tài)（400×）Fig.1 Representative sporulated oocysts of 10species of Eimeriafrom experimental rabbits in Jiangsu province（400×）

表2 江蘇省實(shí)驗(yàn)兔各種球蟲感染百分比Table 2 The percentage of each coccidian species in experimental rabbits in Jiangsu province

3 討論

本試驗(yàn)共調(diào)查了江蘇省蘇北、蘇中、蘇南及南京地區(qū)4個實(shí)驗(yàn)兔基地的兔球蟲感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均有球蟲感染，感染率為100%，且均為多種球蟲的混合感染，此結(jié)果與文獻(xiàn)［3，14］報(bào)道的甘肅、安徽地區(qū)養(yǎng)殖的商業(yè)兔球蟲感染情況一致。據(jù)資料報(bào)道在不同地方的種類不完全一致，本次調(diào)查共查出10種艾美耳球蟲，分別是斯氏艾美耳球蟲、穿孔艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、梨型艾美耳球蟲、無殘艾美耳球蟲、盲腸艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、小型艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲，其中最常見的球蟲是穿孔艾美耳球蟲，所占比例為27.97%，其次為無殘艾美耳球蟲，比例為15.08%，再次為腸艾美耳球蟲，比例為11.47%。本次調(diào)查出的10中兔艾美耳球蟲種類與文獻(xiàn)［10］對國內(nèi)14個省兔場球蟲感染調(diào)查結(jié)果一致，Jing F等［10］報(bào)道國內(nèi)流行率最高的球蟲種類為穿孔艾美耳球蟲，其次為中型艾美耳球蟲，再次為大型艾美耳球蟲、無殘艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲。而馬永華等［3］報(bào)道甘肅蘭州地區(qū)發(fā)現(xiàn)了12種兔球蟲，除以上10種艾美耳球蟲，還報(bào)道了松林艾美耳球蟲和新兔艾美耳球蟲，程寶艷還報(bào)道了報(bào)道安徽肥西地區(qū)發(fā)現(xiàn)那格浦耳艾美耳球蟲［14］。

本次調(diào)查中，蟲種鑒定是從形態(tài)學(xué)方面進(jìn)行的，為了保證球蟲類型鑒定結(jié)果真實(shí)可靠，應(yīng)當(dāng)結(jié)合分子生物學(xué)手段，與形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合，這樣獲得的數(shù)據(jù)才更加可靠。Cere N等［15］根據(jù)球蟲的基因特性鑒別球蟲，Oliveira U C等［16］運(yùn)用PCR方法鑒別了11種兔艾美耳球蟲，這些方法的運(yùn)用有利于從分子水平鑒定蟲種。

現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》，規(guī)定艾美耳球蟲為清潔級兔必要時檢測項(xiàng)目，要求為陰性，而SPF級兔必須檢測艾美耳球蟲，要求為陰性。隨著實(shí)驗(yàn)兔的用量越來越多，應(yīng)用范圍越來越廣泛，國家對實(shí)驗(yàn)兔質(zhì)量控制要求也會越來越高。此次調(diào)查的江蘇地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔球蟲的感染率高達(dá)100%，且全部為混合感染，究其原因可能有以下幾個方面：首先，飼養(yǎng)管理不科學(xué)，衛(wèi)生消毒制度不規(guī)范，造成病原能夠長時間存活在舍內(nèi)，因而兔群長期持續(xù)感染；其次，不能選用正確的藥物進(jìn)行治療和預(yù)防，這樣不利于對球蟲病的控制，藥物濫用或誤用還會增強(qiáng)球蟲的耐藥性，從而難以徹底地消除該病。兔球蟲感染通常呈亞臨床癥狀，兔外觀正常，但可能導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率下降，生長受阻，影響各項(xiàng)生理指標(biāo)，作為教學(xué)與科研用的試驗(yàn)兔更是可能會影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)。鑒于此次調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)兔普遍感染艾美耳球蟲，因此，為確保提供高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)兔，保證科學(xué)實(shí)驗(yàn)順利開展，采取科學(xué)的防治措施防控兔球蟲病的發(fā)生具有十分重要的意義。

［1］ 汪 明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：394.

［2］ 馬永華.兔斯氏艾美耳球蟲活疫苗的研制［D］.甘肅蘭州：西北名民族大學(xué)，2009.

［3］ 馬永華，賈萬忠，閆鴻斌，等.甘肅蘭州地區(qū)屠宰市場兔球蟲病流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（6）：142-145.

［4］ Li M H，Ooi H K.Fecal occult blood manifestation of intestinalEimeriaspp.infection in rabbit［J］.Vet Prasitol，2009，161：327-329.

［5］ Pinard-van der Laan M H，Bed＇hom B，Coville J L，et al.Microsatellite mapping of QTLs affecting resistance to coccidiosis（Eimeria tenella）in a Fayoumi× White Leghorn cross［J］.BMC Genomics，2009，10-31：1471-2164.

［6］ 崔 平，顧小龍，郭 兵.張家口部分兔場球蟲感染情況調(diào)查及形態(tài)學(xué)觀察［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（8）：1923-1925.

［7］ 藏武紅，李成梅，熊朝蘭.兔球蟲病的感染流行調(diào)查及防治措施［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（1）：106-107.

［8］ 禹旺盛，殷翠琴，馬永梅.呼和浩特市某養(yǎng)兔場球蟲感染情況調(diào)查與種類鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（增）：5-8.

［9］ 喬 軍，才學(xué)鵬，田廣孚，等.蘭州地區(qū)兔球蟲種類調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：43-44.

［10］ Jing F，Yin G，Liu X，et al.Large-scale survey of the prevalence of Eimeriainfections in domestic rabbits in China［J］.Parasitol Res，2012，110：1495-1500.

［11］ 周智君，傅童生，張朝陽.湖南省部分地區(qū)實(shí)驗(yàn)兔寄生蟲病調(diào)查［J］.湖南畜牧獸醫(yī)，2002，3：21-22.

［12］ GB 14922.1-2001，實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測中國標(biāo)準(zhǔn)書號［S］.

［13］ 孔繁瑤.家畜寄生蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997：337.

［14］ 程寶艷，徐前明，李培英.安徽省肥西縣家兔球蟲感染情況初步調(diào)查［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（3）：90-93.

［15］ Cere N，Licois D，Humbert J F.Comparison of the genomic fingerprints generated by the random application of polymorphic DNA between precocious lines and parental strains of Eimeriaspp.from the rabbit［J］.Parasitol Res，1997，83：300-302.

［16］ Oliveiraa U C，F(xiàn)ragaa J S，Licois D，et al.Development of molecular assays for the identification of the 11 Eimeria species of the domestic rabbit（Oryctolagus cuniculus）［J］.Vet Prasitol，2011，176：275-280.