抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白單克隆抗體的制備

陳 軼，吳曉東，鄒艷麗，趙金山，包靜月，曹金山，王志亮＊

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266114；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的豬的急性、烈性、高度接觸性傳染?。?］。ASFV是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）惟一成員［2］，為具有囊膜的雙股DNA病毒，蜱類是其主要自然宿主和傳播媒介［3-4］。ASFV感染豬后以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血為臨床特征，病死率極高［5］。因此，ASF是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）要求法定報(bào)告的動物疫病，也是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的一類動物疫病［6］。

ASFV整個(gè)基因組含有160個(gè)～175個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼150種～200種蛋白質(zhì)［7］。根據(jù)Pubmed中所列西班牙BA71V分離株全基因序列顯示，ASFV基因組含有151個(gè)主要閱讀框，編碼數(shù)量眾多的蛋白［7］。VP73蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由B646L基因編碼，全蛋白分子質(zhì)量約為73 ku［8］。VP73蛋白是病毒粒子20面體衣殼的重要組成部分，產(chǎn)生于病毒感染的晚期，約占整個(gè)病毒粒子蛋白的32%［9］。VP73蛋白在ASFV結(jié)合和進(jìn)入易感細(xì)胞過程中有很重要的作用［10］，并對病毒粒子衣殼的產(chǎn)生起至關(guān)重要的作用［11］。ASFV大多數(shù)分離株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性。有研究表明，不同區(qū)域ASFV分離株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗VP73蛋白抗體的相應(yīng)抗原表位都相當(dāng)保守［12］。VP73蛋白的免疫原性很穩(wěn)定［13］，可以被用來作為血清學(xué)檢測和免疫制劑。李倩等［14］對非洲豬瘟病毒VP73蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測。本研究在對ASFV VP73蛋白主要抗原表位區(qū)原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，制備了相應(yīng)的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒、動物和細(xì)胞 宿主菌E.coli BL21（DE3）為Invitrogen公司產(chǎn)品；重組質(zhì)粒pET32a-vp73、非洲豬瘟病毒陽性血清、Balb／c小鼠及小鼠骨髓瘤細(xì)胞株（SP2／0）均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存。

1.1.2 試劑 非預(yù)染蛋白Marker和預(yù)染蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；His Bind Purification Kit為Novagen公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為Biomiga公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗豬IgG均為Sigma公司產(chǎn)品；HT、HAT和DMEM均為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備

1.2.1.1 重組質(zhì)粒的鑒定和表達(dá) 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET32a-vp73，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行30g／L瓊脂糖凝膠電泳。將重組質(zhì)粒pET32a-vp73委托寶生物工程（大連）有限公司測序。將空質(zhì)粒pET32a（＋）和重組質(zhì)粒pET32avp73分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。將重組菌接種至含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖至OD 600nm值約為0.6，加入終濃度為0.8mmol／L的IPTG，誘導(dǎo)4.5h，菌體裂解后，120mL／L SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)情況。

1.2.1.2 目的蛋白的純化及鑒定 按His Bind Purification Kit操作說明純化重組vp73蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。以非洲豬瘟陽性血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗，Western blot鑒定目的蛋白。

1.2.2 MAb的制備

1.2.2.1 動物免疫 初免用弗氏完全佐劑乳化純化的重組vp73蛋白，皮下注射免疫8周齡的Balb／c小鼠（100μg／只）；二免三免用弗氏不完全佐劑乳化純化后的重組vp73蛋白，皮下注射免疫（100 μg／只）；每次免疫間隔14d。于融合前3d以50 μg／只的劑量腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。

1.2.2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 加強(qiáng)免疫Balb／c小鼠3d后，按常規(guī)方法無菌取小鼠脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞在PEG的作用下融合，融合細(xì)胞在含200mL／L胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，5d后半換液，10d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)孔1／5以上時(shí)，吸取培養(yǎng)上清以間接ELISA方法篩選陽性孔，采用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3次克隆化，直至克隆孔陽性率達(dá)到100%，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。

1.2.2.3 腹水誘生 將陽性雜交瘤細(xì)胞以5×105個(gè)／只～10×105個(gè)／只的劑量腹腔注射經(jīng)液體石蠟致敏后的Balb／c小鼠，7d～10d后收集腹水，可取多次，10 000r／min離心10min取上清，分裝標(biāo)記并凍存。

1.2.3 MAb特異性鑒定

1.2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測 將純化后的重組vp73蛋白和含pET-32a（＋）空質(zhì)粒的菌體蛋白，用包被液稀釋至2μg／mL，分別包被ELISA板，以制備的單克隆抗體腹水和培養(yǎng)液上清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行間接ELISA。

1.2.3.2 Western blot檢測 將純化后的重組vp73蛋白和含pET-32a（＋）空質(zhì)粒的菌體蛋白進(jìn)行120mL／L SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜，以制備的單克隆抗體腹水和培養(yǎng)液上清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色。

1.2.3.3 MAb亞類及效價(jià)測定 按說明書操作應(yīng)用MAb亞類鑒定試劑盒對MAb的亞類進(jìn)行鑒定。單抗腹水作倍比稀釋，采用間接ELISA測定單抗腹水的效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定與測序結(jié)果

酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，獲得大小約為612bp的目的DNA片段及5 900bp左右的pET-32a（＋）載體片段，初步表明重組質(zhì)粒中含有預(yù)期大小的目的DNA片段（圖1）。測序結(jié)果表明，載體插入目的DNA片段長度為612 bp，與GenBank中的非洲豬瘟病毒VP73基因序列（登陸號S89966，627bp～1 238bp）比對結(jié)果一致，證明目的DNA片段插入正確。

圖1 重組質(zhì)粒pET32a-vp73酶切分析Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET32a-vp73with enzyme digestion

2.2 目的蛋白SDS-PAGE電泳、純化、濃度測定及Western blot檢測

120mL／L SDS-PAGE電泳結(jié)果分析表明重組菌在終濃度為0.8mmol／L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4.5 h后可產(chǎn)生大小約為43ku的融合蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致，且目的蛋白純化效果較好（圖2）。純化后目的蛋白濃度為2.5mg／mL。Western blot檢測表明該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性（圖3）。

2.3 細(xì)胞株的篩選及克隆化

經(jīng)篩選，得到3株（1C8、2D5、5F6）針對 ASFV VP73蛋白主要抗原表位區(qū)的MAb雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)三次亞克隆后陽性率達(dá)到100%，雜交瘤凍存復(fù)蘇后，其中兩株（2D5、5F6）喪失分泌抗體的能力，最終得到一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1C8）。

圖2 pET32a-vp73表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of pET32a-vp73expression products and purified products

圖3 VP73蛋白的免疫印跡分析Fig.3 Western blot analysis of VP73protein

2.4 MAb的鑒定

2.4.1 ELISA檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，雜交瘤（1C8）培養(yǎng)上清和腹水與重組蛋白VP73具有較強(qiáng)的反應(yīng)性，而不與含pET-32a（＋）空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白反應(yīng)（表1）。

表1 單抗（1C8）特異性分析Table 1 Specificities of MAb tested by indirect ELISA

2.4.2 Western blot檢測結(jié)果 蛋白檢測結(jié)果顯示，該株MAb可特異性識別非洲豬瘟病毒重組VP73蛋白，而不與含pET-32a（＋）空質(zhì)粒表達(dá)的菌體蛋白反應(yīng)（圖4）。

圖4 腹水單抗的Western blot檢測Fig.4 Western blot analysis of the monoclonal antibody in ascites

2.4.3 腹水效價(jià)及抗體亞類鑒定結(jié)果 1C8的腹水抗體效價(jià)達(dá)到1.024×105?？贵w亞類鑒定結(jié)果表明，該MAb抗體類型為IgG1亞類。

3 討論

ASFV基因組是大分子線狀雙鏈DNA，通過雙向凝膠電泳證實(shí)ASFV粒子大約含有50種蛋白質(zhì)，這些蛋白是構(gòu)成ASFV粒子結(jié)構(gòu)的主要成分。VP73蛋白是ASFV主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在病毒粒子中含量最大，且被證明具有較強(qiáng)的抗原性。VP73參與了病毒的吸附過程，針對VP73的抗體可以阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。

本研究原核表達(dá)了VP73蛋白基因主要抗原表位區(qū)，通過免疫印跡分析法驗(yàn)證了該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性，在此基礎(chǔ)上以該蛋白作為抗原免疫小鼠，最終獲得了一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株1C8。ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明，所制備的MAb具有較強(qiáng)的特異性，有較高的抗體效價(jià)。

國外有研究表明，雖然ASFV基因中負(fù)責(zé)免疫逃避機(jī)制的基因序列已經(jīng)確定［15-16］，疫苗的研制也出現(xiàn)了一定的轉(zhuǎn)機(jī)，但是短期內(nèi)成功制備有效的疫苗仍有一定困難［12］。而最近五年來，ASF一直在歐亞大陸接壤的高加索地區(qū)三國以及俄羅斯聯(lián)邦的部分地區(qū)肆虐，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失［12］；我國北方的生態(tài)環(huán)境和動物分布與ASF流行地區(qū)相似，ASF對我國威脅很大?？狗侵挢i瘟病毒VP73蛋白MAb的成功制備，為隨后建立快速準(zhǔn)確的ASFV血清學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

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