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    H1和H3亞型禽流感病毒二重PCR 檢測(cè)方法的建立

    2012-08-14 08:01:48謝芝勛劉加波謝志勤龐耀珊鄧顯文謝麗基
    關(guān)鍵詞:禽流感亞型敏感性

    郭 捷,謝芝勛,彭 宜,劉加波,謝志勤,龐耀珊,鄧顯文,謝麗基

    (1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530004;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧530001)

    禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬中不同亞型病毒引起的禽類(lèi)感染和疾病的總稱(chēng)。禽流感病毒(AIV)為單股負(fù)鏈RNA病毒,由8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成,根據(jù)其表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異,可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。其中H1和H3亞型AIV雖然屬于低致病性AIV,在禽類(lèi)中沒(méi)有表現(xiàn)出明顯癥狀,較少出現(xiàn)死亡,但在人類(lèi)流感中H1和H3亞型流感病毒引起過(guò)世界性的大流行[2],20世紀(jì)全球發(fā)生過(guò)3次流感大流行都是由H1亞型或H3亞型流感病毒造成的,尚且不能證明這幾次大流行流感的2種亞型病毒來(lái)自于禽類(lèi),但可以推斷禽源H1和H3亞型AIV為人類(lèi)流感病毒提供了基因片段,從而間接的威脅著人類(lèi)的身體健康,具有重要的公共衛(wèi)生意義[3-7]。所以,建立同時(shí)快速檢測(cè)H1和H3亞型AIV的方法,對(duì)這兩種亞型禽流感病毒感染的診斷和控制非常關(guān)鍵。

    目前對(duì)H1和H3亞型AIV感染的鑒別診斷主要依靠傳統(tǒng)的病原分離鑒定與血清學(xué)試驗(yàn),這些方法有一定的局限性,不能同時(shí)檢測(cè)出這兩種亞型AIV。因此,本研究選擇一種具有敏感性高、特異性好、快速、簡(jiǎn)便的PCR檢測(cè)方法用于鑒別診斷H1和H3亞型禽流感病毒感染。相對(duì)于單項(xiàng)PCR技術(shù),二重PCR技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)并鑒別出兩種病原體,在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。此方法已被廣泛應(yīng)用于一些病原微生物的檢測(cè)中,并且具有良好的敏感性和特異性[8-12]。本試驗(yàn)的目的在于建立一次PCR反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)和鑒別H1和H3兩種亞型禽流感病毒的二重PCR方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 毒株 H1、H3、H6、H9亞型AIV由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定;H5N2、H7N2亞型AIV RNA由美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈(zèng);新城疫病毒(NDV)F48、傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)北京株及雞毒支原體(MG)86由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

    1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol LS Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DU 800紫外分光光度計(jì)為Beckman Coulter公司產(chǎn)品;SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的H1亞型和H3亞型AIV-HA基因的保守核苷酸序列,應(yīng)用DNA Star軟件和Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)針對(duì)H1亞型和H3亞型AIV基因序列的2對(duì)特異性引物,其中H1亞型AIV擴(kuò)增302bp,H3亞型AIV為626bp,引物核酸序列見(jiàn)表1。引物由Invitrogen公司合成,儲(chǔ)存液濃度為50pmol/μL,置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄 參照Trizol LS Reagent使用說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)[10]進(jìn)行病毒RNA抽提,向抽提后的RNA中加入35μL DEPC水和1.5 μL反轉(zhuǎn)錄引物:70℃10min,冰浴5min;加入反轉(zhuǎn)錄體系:10μL 5×M-Mulv buffer、2μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑、1μL AMV,瞬時(shí)離心,42℃經(jīng)90min。制備的cDNA置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 H1和H3引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of H1and H3primers

    1.2.3 二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化 總反應(yīng)體積為25μL,其中2×PCR Master Mix 12.5μL,H1亞型AIV cDNA和H3亞型AIV cDNA共2μL作為混合模板,引物 H1-F、H1-R各加入0.4μL,H3-F、H3-R各加入0.6μL,最后用雙蒸水補(bǔ)至25μL。對(duì)二重PCR的各引物濃度及PCR反應(yīng)的各參數(shù)(溫度、時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化,以篩選出二重PCR反應(yīng)體系中最佳的反應(yīng)模式。

    1.2.4 二重PCR的特異性試驗(yàn) 利用本研究?jī)?yōu)化好的二重PCR反應(yīng)體系,同時(shí)擴(kuò)增H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型 AIV、NDV、IBV、ILTV 及 MG的核苷酸進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)其特異性。

    1.2.5 二重PCR的敏感性試驗(yàn) 將制備好的H1 AIV和H3AIV RNA按10倍倍比稀釋?zhuān)肂eckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄后采用最佳引物濃度和二重PCR反應(yīng)模式,分別對(duì)上述模板進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性。

    1.2.6 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用所建立的PCR方法,對(duì)17份從廣西南寧市活禽市場(chǎng)采集的口腔和糞便拭子進(jìn)行RNA提取,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 二重PCR條件的優(yōu)化

    通過(guò)對(duì)H1亞型AIV、H3亞型AIV 2種引物濃度的測(cè)定及二重PCR擴(kuò)增的溫度、時(shí)間等的優(yōu)化,最后確定二重PCR最佳反應(yīng)體系:2×PCR Master Mix 12.5μL,H1亞型AIV上下引物(50 pmol/μL)各0.1μL,H3亞型 AIV 上下引物(50 pmol/μL)各0.4μL,混合模板2μL,加水至25μL。二重PCR的最佳反應(yīng)模式為:94℃4min;94℃50 s,56℃50s,72℃ 1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃結(jié)束反應(yīng)。其PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,觀察結(jié)果并拍照。

    2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

    特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,含有H1亞型AIV、H3亞型AIV的核酸樣品均能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的302bp和626bp 2個(gè)明亮條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1);而其他亞型流感病毒和禽呼吸道疾病病原均未擴(kuò)增出任何條帶,說(shuō)明該方法有較好的特異性。

    圖1 二重PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Specificity results of duplex PCR

    2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)得H1亞型AIV和H3亞型AIV總RNA濃度分別為500 ng/μL、260ng/μL,應(yīng)用優(yōu)化后的二重PCR方法對(duì)10倍梯度稀釋的H1亞型AIV、H3亞型AIV核酸模板進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,該二重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到50pg的H1亞型AIV和26pg的H3亞型AIV核酸模板(圖2)。

    圖2 二重PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity results of duplex PCR

    2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

    在廣西南寧市17份活禽市場(chǎng)樣品中,抽提RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行二重PCR檢測(cè),結(jié)果有4份為H1亞型AIV陽(yáng)性,5份為H3亞型AIV陽(yáng)性(圖3),與病毒分離鑒定的結(jié)果一致。

    3 討論

    AIV 16種HA亞型中,H1亞型和H3亞型屬于低致病性禽流感病毒,但在人類(lèi)流感病毒中,自1997年起,H1N1型與H3N2型在人群中交替流行,嚴(yán)重影響了人類(lèi)的身體健康[13-15],其中的基因片段有可能來(lái)自于禽流感的H1和H3亞型。因此,本研究針對(duì)H1亞型AIV-HA基因和H3亞型AIV-HA基因,設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物,使該P(yáng)CR反應(yīng)能同時(shí)擴(kuò)增出針對(duì)H1亞型和H3亞型AIV的目的片段,對(duì)我國(guó)現(xiàn)有H1亞型和H3亞型AIV的檢測(cè)有十分重要的意義。

    圖3 二重PCR檢測(cè)臨床樣品的結(jié)果Fig.3 The detection results of clinical samples by duplex PCR

    因?yàn)楦腥綡1和H3亞型禽流感病毒的禽類(lèi)不會(huì)表現(xiàn)明顯的臨床癥狀,也很難通過(guò)病理組織變化觀察進(jìn)行鑒定。另外,傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法敏感性不高。本研究所建立的二重PCR,對(duì)含有H1亞型AIV毒株、H3亞型AIV毒株進(jìn)行了二重PCR檢測(cè),結(jié)果均同時(shí)得到了與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的擴(kuò)增條帶,而對(duì)其他對(duì)照病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的二重PCR特異性良好。同時(shí),利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小的不同直接判定擴(kuò)增結(jié)果,使得該方法在結(jié)果判定上更加直觀、簡(jiǎn)便。另外,敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,該二重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到50pg H1亞型AIV模板,26pg H3亞型AIV模板,可以看出該二重PCR方法敏感性較高。通過(guò)臨床檢測(cè),也體現(xiàn)出來(lái)該二重PCR方法的高度準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性。

    綜上所述,本研究所建立的二重PCR方法,對(duì)同時(shí)鑒別檢測(cè)H1亞型AIV和H3亞型AIV具有簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn),為H1和H3亞型禽流感的診斷和監(jiān)控提供了技術(shù)手段。

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