葡萄糖酸鋅對心肌缺血／再灌注損傷保護作用的動物實驗研究＊

劉 丹，孫品蘭，羅明軍，黃 春，張樂星，譚祥惠

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 萬州 404120）

心肌缺血／再灌注損傷既是不可預(yù)知的（如心肌梗死），也是不可避免的（如冠狀動脈搭橋術(shù)、冠狀動脈溶栓術(shù)、冠狀動脈再通術(shù)等），所以探索其發(fā)生機制及防治藥物越來越重要。有研究表明，鋅可抑制·OH生成，對心臟、肝臟和腦等多種器官的缺血／再灌注損傷（IR）有保護作用。但關(guān)于葡萄糖酸鋅（zinc gluconate，ZG）是否可以通過抑制·OH生成，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善心肌能量代謝，進而減輕鈣超載；減少細(xì)胞因子IL－1β的釋放，抑制炎癥反應(yīng)，保護缺血／再灌注損傷心肌，報道較少。所以本實驗擬研究ZG對心肌缺血／再灌注損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠（重慶市中藥研究院實驗動物中心提供）50只，雄性，體質(zhì)量250～280g。主要試劑:ZG（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙 二 醛 （malondraldehyde，MDA）、Na＋－K＋－ATP 酶（Na＋－K＋－ATPase）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠IL－1βELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血／再灌注損傷實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓捌浞纸M

1.2.1.1 分組 按隨機化原則分為5組（每組10只）:（1）ZG 3個劑量組，即 167［1／15 半 數(shù)致死劑量 （LD50）］、250（1／10 LD50）、357（1／7LD50）mg／kg劑量組，分別以相應(yīng)劑量ZG（溶于蒸餾水中，2mL）灌胃，每次2mL，上、下午各1次，依據(jù)ZG的半衰期（t1／2）:t1／2（h）＝2.46±0.30［1］，兩次灌胃給藥間隔時間為2.5h。于末次灌胃1h后行冠狀動脈左前降支結(jié)扎30 min，再灌注60min。（2）模型組，給予ZG各劑量組等容量的生理鹽水4mL灌胃，其他處理同上。（3）假手術(shù)組，只穿線不結(jié)扎，其他處理同上。

1.2.1.2 模型制作 大鼠心肌缺血／再灌注損傷實驗?zāi)Ｐ停?］:取雄性SD大鼠，以烏拉坦（1g／kg）腹腔注射。描記肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，自左側(cè)第1～3肋開胸，采用人工呼吸機正壓呼吸。暴露大鼠心臟后，拉緊結(jié)扎線，使硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而致閉塞30min，而后切斷結(jié)扎線再灌注60 min。冠狀動脈斷流及再通成功與否以心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高及恢復(fù)作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 檢測指標(biāo)

1.2.2.1 大鼠心肌組織中IL－1β含量的測定 于實驗結(jié)束后立即取左室游離心肌組織0.1g，用4℃冰生理鹽水將血液洗凈，按組織與生理鹽水1∶9的比例制備組織勻漿。離心（3000r／min，15min），取上清液備用。用ELISA法測定心肌組織中IL－1β的含量。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）。操作步驟按武漢博士德生物工程有限公司試劑盒說明書進行。

1.2.2.2 大鼠心肌組織中Na＋－K＋－ATPase和SOD活性、MDA和Ca2＋含量的測定 于實驗結(jié)束后立即取左室游離心肌組織0.4g，制備組織勻漿，取上清液備用。Na＋－K＋－ATPase用比色法測定，SOD用羥胺法測定，MDA用硫代巴比妥酸法測定，蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定，操作步驟按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。Ca2＋用離子電極直接測定法，在自動生化分析儀上測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZG對心肌缺血／再灌注損傷大鼠心肌組織中Na＋－K＋－ATPase活性、IL－1β和Ca2＋含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中 Na＋－K＋－ATPase活性降低，IL－1β和Ca2＋含量升高（P＜0.01），與模型組相比，ZG 3個不同劑量組大鼠心肌組織中 Na＋－K＋－ATPase活性升高（P＜0.01），IL－1β和Ca2＋含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌組織中Na＋－K＋－ATPase活性、IL－1β和Ca2＋含量的變化（）

a:P＜0.01，與假手術(shù)組相比；c:P＜0.05，b:P＜0.01，與模型組比較。

組別 Na＋－K＋－ATPase（U／mgprot）IL－1β（pg／mL）Ca2＋（mg／L）假手術(shù)組1.93±0.32 2345.25±55.775.89±0.85模型組 1.08±0.22a 3522.96±145.63a9.63±1.43a ZG組（ng／kg）167 1.56±0.21b 3020.38±128.35b 7.49±1.47c 250 1.69±0.21b 2832.40±78.69b 6.94±1.25b 357 1.85±0.33b 2642.10±107.70b 6.27±1.14b

表2 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量的變化（）

表2 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量的變化（）

a:P＜0.01，與假手術(shù)組比較；c:P＜0.05，b:P＜0.01，與模型組比較。

組別 SOD（U／mgprot） MDA（nmol／mgprot）假手術(shù)組118.54±30.34 2.41±0.33模型組 67.16±17.01a 5.72±0.73a ZG組（mg／kg）167 80.86±16.01c 3.34±0.41b 250 90.95±24.95b 2.89±0.29b 357 101.11±13.56b 2.58±0.37b

2.2 ZG對心肌缺血／再灌注損傷大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD活性降低和MDA含量升高（P＜0.01），與模型組相比ZG 3個不同劑量組大鼠心肌組織中SOD活性升高（P＜0.05）和MDA含量降低（P＜0.01）。見表2。

3 討 論

心肌缺血／再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，主要原因是在再灌注過程中產(chǎn)生了大量的氧自由基（OFR）、Ca2＋超載、中性粒細(xì)胞浸潤引起炎癥反應(yīng)，能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)失衡［3－5］。它們之間互為因果、互相影響。其中，OFR和Ca2＋超載成為細(xì)胞致死的主要原因［6］。

心肌缺血／再灌注時，因高能磷酸化合物減少而使Na＋－K＋－ATPase活性降低，結(jié)果導(dǎo)致大量Na＋經(jīng)L型Ca2＋通道進入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Na＋增高，進而激活Na＋－Ca2＋交換機制，使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋增高。同時因能量不足，使肌膜及肌漿網(wǎng)（SR）的Ca＋－ATPase活性降低，不能將肌漿中過多的Ca2＋泵出或攝入肌漿網(wǎng)，細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流，最終導(dǎo)致Ca2＋超載［7－8］。Ca2＋與細(xì)胞質(zhì)受體鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，可激活蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變成黃嘌呤氧化酶（XO），缺血時，產(chǎn)生黃嘌呤。當(dāng)再灌注后，黃嘌呤在XO的作用下生成超氧陰離子自由基）及過氧化氫（H2O2），除直接損傷細(xì)胞外，還可通過Haber－Weiss反應(yīng)轉(zhuǎn)變成·OH，然后經(jīng)瀑布反應(yīng)生成其他自由基［9］。在OFR中主要是·OH引起心肌損傷，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，再經(jīng)過氧化物酶分解生成 M DA，最終造成肌纖維過度收縮，三磷酸腺苷耗竭，線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，使依賴能量的離子泵活性降低，進而促進鈣超載。

IL－1β在心肌缺血／再灌注時表達(dá)水平增高。已有研究證實，細(xì)胞因子IL－1β和黏附分子（ICAM－1）在心臟移植后缺血／再灌注損傷的病理過程中起著重要作用［10］。其引起心肌損傷的機制可能有:IL－1可直接上調(diào)ICAM－1和內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子－1（ELAM－1）表達(dá)，而ICAM－1、ELAM－1誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞（PMN）黏附在內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮下基質(zhì)并穿過內(nèi)皮遷移流入缺血區(qū)，通過阻塞微血管、釋放OFR等機制導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，使梗死過程加?。?1］。同時Ca2＋也能激活PMN引起呼吸爆發(fā)，可產(chǎn)生大量的OFR，損傷細(xì)胞。

心肌缺血／再灌注時，鋅對黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系所引發(fā)的OFR有抑制作用，它能減少鐵離子進入細(xì)胞并抵制其在羥自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的催化作用［12］，有實驗證實，外源給鋅可以明顯減輕肝臟缺血／再灌注損傷，抗脂質(zhì)過氧化和抑制ICAM－1／VCAM－1表達(dá)是其作用的重要機制［13］。心肌缺血／再灌注損傷時，補鋅組血清和心肌組織中MDA含量降低、SOD 活性升高［14］。

本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，ZG 3個不同劑量組大鼠心肌組織中SOD活性升高和MDA含量降低。有研究表明，在缺血／再灌注時，及時補充能量，可減少OFR的生成及減輕Ca2＋超載，促進心肌功能恢復(fù)。與模型組相比，Na＋－K＋－AT Pase活性升高，Ca2＋和IL－1β含量降低。提示ZG對心肌缺血／再灌注損傷有保護作用，其作用與抑制·OH生成，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時葡萄糖增加血液循環(huán)中糖酵解底物濃度，促進心肌功能恢復(fù)，升高Na＋－K＋－ATPase活性，進而減輕Ca2＋超載；減少IL－1β釋放，抑制炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果可為臨床應(yīng)用鋅制劑治療心肌缺血／再灌注損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。

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