骨髓單個(gè)核細(xì)胞促進(jìn)腱骨愈合的生物力學(xué)測(cè)試

李 寧，張義龍，李淑英，李志懷

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外一科，河北 承德 067000）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷后常導(dǎo)致嚴(yán)重的膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，從而引起繼發(fā)的半月板和關(guān)節(jié)軟骨的損傷，為恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)和功能，常需要手術(shù)行ACL重建術(shù)。在移植物的選擇方面，腘繩肌腱近年來(lái)應(yīng)用較多，主要是因?yàn)樗墓赡N繩肌腱強(qiáng)度較高，取材部位創(chuàng)傷小，術(shù)后恢復(fù)快［1］。但是，移植肌腱在骨道中的愈合屬于腱－骨愈合，相對(duì)于骨－骨界面愈合，其愈合時(shí)間較長(zhǎng)［2］，限制了患者早期的康復(fù)練習(xí)。如何促進(jìn)腱－骨愈合成為近年來(lái)學(xué)者們關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)在骨道中注入自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以促進(jìn)腱－骨界面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24只新西蘭大白兔（由承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量2.0～2.5kg，平均2.26kg。實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)雙側(cè)膝關(guān)節(jié)未見畸形，前后抽屜試驗(yàn)及側(cè)方應(yīng)力試驗(yàn)均陰性。雙側(cè)膝關(guān)節(jié)均接受手術(shù)，隨機(jī)選取一側(cè)膝關(guān)節(jié)作為實(shí)驗(yàn)側(cè)，對(duì)側(cè)作為對(duì)照側(cè)。

1.1.2 醫(yī)用耳腦膠 醫(yī)用耳腦膠為廣州白云醫(yī)用膠有限公司生產(chǎn)，固化時(shí)間小于15s，聚合熱低，局部刺激小，體表應(yīng)用固化膜脫落為7～10d，體內(nèi)約4周可降解為水溶性物隨代謝排出體外。

1.2 方法

1.2.1 自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲得 經(jīng)耳緣靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液（1mL／kg）將動(dòng)物麻醉，雙側(cè)髂骨部消毒，用含有0.5mL肝素的10mL注射器，從雙側(cè)髂骨快速抽取骨髓各5mL，放入無(wú)菌離心管，1500r／min離心15min，取中間細(xì)胞層移入另一管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）后再次1500r／min離心10min，棄上清，保留沉淀部分，再加入0.5mL PBS液吹打成單核細(xì)胞懸液，備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 在麻醉狀態(tài)下，雙膝術(shù)區(qū)備皮、消毒，取髕腱內(nèi)側(cè)縱行切口，于脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)后、大腿內(nèi)側(cè)，分離出半腱肌腱，保留遠(yuǎn)端止點(diǎn)完整，自腱和肌腹交界處近端切斷，肌腱斷端用4－0的肌腱編織線編織作為牽引線；于半腱肌腱遠(yuǎn)端止點(diǎn)處鑿取5.0mm×3.5mm×3.5mm大小骨塊連同半腱肌腱共同切下做成肌腱－骨塊復(fù)合體備用。沿髕腱內(nèi)側(cè)切開至關(guān)節(jié)腔，外推髕骨致脫位，切斷翼狀皺襞，于上、下止點(diǎn)處完整切除ACL，查前抽屜試驗(yàn)及Lachman試驗(yàn)為陽(yáng)性，然后用2 mm鉆頭自脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)上骨面向原前交叉韌帶下止點(diǎn)鉆取骨道，通過(guò)該骨道再向上、外、后至髁間窩外側(cè)壁后部，近ACL上止點(diǎn)處鉆取骨道，鉆通至股骨外髁外側(cè)骨面，然后改用3.5mm鉆頭于股骨骨道外側(cè)由外向內(nèi)擴(kuò)大股骨骨道深達(dá)5mm，使股骨骨道呈瓶頸樣，適應(yīng)半腱肌腱一端骨塊嵌入。用直針引導(dǎo)牽引線，將一端帶骨塊的半腱肌腱肌腱側(cè)自股骨骨道外口導(dǎo)入關(guān)節(jié)腔，從脛骨骨道拉出，拉緊時(shí)骨塊嵌入股骨骨道外側(cè)端，于屈膝30°位拉緊，經(jīng)脛骨骨橋，懸吊固定。查前抽屜試驗(yàn)及Lachman試驗(yàn)陰性后，慶大霉素鹽水沖洗創(chuàng)口。實(shí)驗(yàn)側(cè)先將脛骨側(cè)骨道內(nèi)口涂薄層耳腦膠封閉內(nèi)口，將準(zhǔn)備好的骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液用注射器針頭通過(guò)脛骨骨道外口注入脛骨骨道，邊注邊退，完畢后用耳腦膠封閉外口。對(duì)照側(cè)不予注射細(xì)胞，而僅于脛骨骨道內(nèi)外口封閉薄層耳腦膠。創(chuàng)口逐層間斷縫合，患肢不予以固定，傷口常規(guī)換藥，肌注青霉素3d預(yù)防感染。術(shù)后籠養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.2.3 生物力學(xué)檢測(cè) 于術(shù)后2、4、8、12周分別將6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死取材，將膝關(guān)節(jié)ACL外周圍軟組織去除，股骨和脛骨各保留3cm長(zhǎng)，股骨與脛骨端分別固定于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（MTS 858Mini Bionix）上，使拉力經(jīng)過(guò)韌帶的軸線。測(cè)試前將脛骨端移植肌腱骨道外的軟組織及縫線結(jié)均去除，以期望使脛骨端腱－骨界面成為拉力測(cè)試對(duì)象，行最大拉脫負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，測(cè)試移植肌腱的腱－骨界面抗拉伸強(qiáng)度，按5mm／min速度加載負(fù)荷，記錄拉脫或斷裂負(fù)荷及重建韌帶的斷裂部位。因各測(cè)試對(duì)象的移植肌腱的長(zhǎng)度、骨道直徑和長(zhǎng)度接近，各組樣本的最大載荷未用隧道長(zhǎng)度來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，直接取其絕對(duì)值作比較。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察結(jié)果 24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)術(shù)后感染，處理標(biāo)本時(shí)見膝關(guān)節(jié)重建的ACL連續(xù)性完整，其中4只實(shí)驗(yàn)側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)見輕微的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)腔少量積液，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見異位骨化，未見纖維組織過(guò)度形成及關(guān)節(jié)僵直。

表1 重建韌帶斷裂部位（n）

表2 最大抗拉脫（斷）強(qiáng)度（，N）

表2 最大抗拉脫（斷）強(qiáng)度（，N）

時(shí)間（周） 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組t P 2 11.78±2.3211.44±2.080.272 ＞0.054 21.97±3.0816.29±2.033.769 ＜0.058 29.97±2.6921.62±2.026.076 ＜0.0512 34.82±2.5531.39±2.512.347 ＜0.05

2.2 生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 為了更有效地觀察腱－骨界面的效果，本實(shí)驗(yàn)股骨側(cè)采用骨塊鑲嵌式固定，旨在使股骨側(cè)達(dá)到更大的固定強(qiáng)度，在拉伸試驗(yàn)中，主要觀測(cè)脛骨側(cè)腱－骨界面的抗拉伸強(qiáng)度。在術(shù)后2、4、8周，重建韌帶斷裂均發(fā)生在脛骨骨道內(nèi)，即韌帶由骨道內(nèi)拔出。術(shù)后12周，對(duì)照側(cè)有1例自肌腱部分?jǐn)嗔眩?例從脛骨骨道拔出；實(shí)驗(yàn)側(cè)有3例自肌腱部分?jǐn)嗔眩?例從脛骨骨道拔出。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未見骨塊完全從股骨骨道拔出（表1）。隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)的抗拉斷強(qiáng)度均有增加；術(shù)后2周，兩組數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在術(shù)后4、8、12周抗拉斷強(qiáng)度的測(cè)試結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)側(cè)抗拉斷強(qiáng)度與對(duì)照側(cè)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即實(shí)驗(yàn)側(cè)抗拉斷強(qiáng)度大于對(duì)照側(cè)，見表2。

3 討 論

目前，ACL重建的方法很多，由于腘繩肌肌腱取材方便、創(chuàng)傷小、強(qiáng)度可靠、取材后對(duì)供區(qū)功能影響小，故臨床應(yīng)用較多。然而，這需要移植物的肌腱組織與骨道的骨組織形成腱－骨愈合，這是一個(gè)纖維組織形成連接，新骨形成，骨向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，局部纖維不斷重建的復(fù)雜過(guò)程［3－5］。在術(shù)后早期，腱－骨界面成為愈合過(guò)程中最薄弱的環(huán)節(jié)，尤其是腱骨組織處于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的內(nèi)環(huán)境中。因此，許多學(xué)者認(rèn)為針對(duì)此種術(shù)式的術(shù)后康復(fù)治療時(shí)間需要“延長(zhǎng)至術(shù)后8周”。移植物與骨道形成牢固的固定連接可以有利于早期積極地行功能康復(fù)練習(xí)［6］，促進(jìn)膝關(guān)節(jié)功能的康復(fù)，所以肌腱移植物在骨道中形成有效的愈合對(duì)于ACL的成功重建是非常必要的。

骨髓中富含基質(zhì)干細(xì)胞、骨祖細(xì)胞和骨內(nèi)膜細(xì)胞等，骨髓成骨特性近年來(lái)的研究主要集中在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的作用上。Lim等［7］在兔身上用含骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的纖維蛋白膠涂抹在自身腘繩肌腱上重建ACL，對(duì)照側(cè)與實(shí)驗(yàn)側(cè)的生物力學(xué)測(cè)試在術(shù)后2周與4周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第8周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)的最大拔出負(fù)荷和剛度明顯高于對(duì)照側(cè)，提示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)腱－骨結(jié)合部位的愈合。骨髓中的有核細(xì)胞為每毫升32×106個(gè)，每18000個(gè)有核細(xì)胞中僅有1個(gè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，即每毫升骨髓中有約2000個(gè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞［8］。雖濃度很低，但Karaoglu等［9］的研究顯示，新鮮骨髓組織同樣有促進(jìn)腱骨愈合的作用，提示骨髓的成骨特性可能基于骨髓內(nèi)諸多成分的相互作用。為加強(qiáng)重建術(shù)后骨道內(nèi)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞濃度，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心提取技術(shù)，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞提取后直接注于腱骨界面，操作簡(jiǎn)潔，避免了細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程有可能帶來(lái)的污染、細(xì)胞活性差等問(wèn)題。采用耳腦膠對(duì)骨道口進(jìn)行封閉，耳腦膠的固化時(shí)間小于15s，聚合熱低，局部刺激小，在體內(nèi)約4周可降解為水溶性物而進(jìn)入體內(nèi)代謝排出，以往常用于腦脊液漏的修補(bǔ)。應(yīng)用耳腦膠封閉骨髓道口后，隔斷了關(guān)節(jié)腔與骨道內(nèi)的聯(lián)系，理論上一定時(shí)間段內(nèi)避免了關(guān)節(jié)液對(duì)骨髓道內(nèi)基質(zhì)干細(xì)胞的稀釋及基質(zhì)干細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔流失。

有效的腱骨愈合還需要避免受關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液中抑制因素作用的影響。Berg等［10］在兔子的膝關(guān)節(jié)做平行于ACL的股骨和脛骨髓道，觀察髓道在關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境下愈合的情況，顯示骨髓道在遠(yuǎn)離關(guān)節(jié)腔的部分明顯比靠近關(guān)節(jié)腔的部分愈合要好，越靠近關(guān)節(jié)腔，愈合的時(shí)間越長(zhǎng)。運(yùn)用肌腱移植物進(jìn)行ACL重建時(shí)，腱－骨愈合同樣處于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的條件之下。Demirag等［11］用α2－巨球蛋白阻斷關(guān)節(jié)滑液內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的效應(yīng)，促進(jìn)腱－骨界面的愈合，證實(shí)關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)腱骨愈合存在不利影響。鑒于此，實(shí)驗(yàn)中采用了耳腦膠對(duì)骨道口進(jìn)行封閉，利用其固化時(shí)間短、局部刺激小、在體內(nèi)可降解時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，除阻斷關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液的稀釋作用外，還避免受關(guān)節(jié)液內(nèi)抑制因子的影響，更好地促進(jìn)骨髓道內(nèi)新骨的形成和腱－骨界面膠原纖維的重建，增加腱骨界面的結(jié)合力［12］。

本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后4、8、12周實(shí)驗(yàn)側(cè)的腱－骨界面愈合強(qiáng)度均強(qiáng)于對(duì)照側(cè)。術(shù)后12周，對(duì)照側(cè)有1例自肌腱部分?jǐn)嗔眩?例從脛骨髓道拔出；實(shí)驗(yàn)側(cè)有3例自肌腱部分?jǐn)嗔眩?例從脛骨髓道拔出。說(shuō)明在干預(yù)措施影響下，術(shù)后腱－骨界面的愈合強(qiáng)度得到了增加，提示自體骨髓移植的有效性。實(shí)驗(yàn)中未見有從股骨側(cè)拔出者，說(shuō)明了骨塊鑲嵌式固定技術(shù)具有較高的固定強(qiáng)度，可以進(jìn)一步在臨床中應(yīng)用［13］。

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