針康法對局灶性海馬缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及突觸素表達的影響

趙振峰，金翊思

腦卒中患者常出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，學(xué)習(xí)記憶障礙不僅影響患者的軀體功能恢復(fù)，也嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。針康法是一種中西醫(yī)結(jié)合的綜合康復(fù)方法，廣泛在腦卒中康復(fù)中應(yīng)用，能夠明顯提高腦梗死患者日常生活能力，改善認知功能[1-2]，降低腦水腫，促進室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖和分化[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性是腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，突觸的重建是其關(guān)鍵步驟。突觸素P38是一種存在于突觸小泡膜上的鈣結(jié)合糖蛋白，參與囊泡的轉(zhuǎn)運和排放，突觸重建時其表達增多，是突觸重建的重要標(biāo)記物，與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切[3]。為此，本實驗通過觀察局灶性海馬缺血大鼠針康法干預(yù)后突觸素P38的變化情況，探討其對學(xué)習(xí)記憶能力影響作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級雄性SD大鼠50只，體重200～250 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號SCXK(京)2009-0001)。將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組、康復(fù)組和針康組，每組10只。

1.2 試劑和儀器 虎紅粉劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；冷光源(哈爾濱工業(yè)大學(xué))；Morris水迷宮(華北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；Y-型迷宮(淮安市天劍工具廠)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 參照采用光化學(xué)法誘導(dǎo)法[4]：大鼠用10%水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射進行麻醉后，將大鼠采取俯臥位放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中切開大鼠頭皮暴露出顱骨，找到前囟點，在前囟點后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處，用牙科鉆鉆開一個直徑約1 mm的骨窗，光纖管尾端至硬膜下3.3 mm。腹腔注射1.5%(生理鹽水稀釋)虎紅70 mg/kg，注射時間2 min。5 min后照射局部海馬組織5 min。術(shù)后縫合頭皮，正常喂養(yǎng)。模型成功后24 h進行干預(yù)。

1.3.2 干預(yù)方法 假手術(shù)組：不造模，常規(guī)麻醉，沿頭顱切開頭皮，用牙科鉆在前囟后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處鉆孔，然后縫合頭皮。

模型組：造模后不進行任何處理，自然恢復(fù)。

頭穴叢刺組：參照華興邦等研制的《大鼠穴位針灸圖譜》，于造模后采用于致順頭部腧穴七區(qū)劃分法取頂區(qū)。針具選擇0.25×15 mm，進針3～10 mm，留針6 h。

康復(fù)組：造模后進行Morris水迷宮訓(xùn)練，從平臺所在象限外的另外3個象限隨機選擇入水點，將大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即潛伏期。如果大鼠2 min之內(nèi)找不到平臺，則將其放在平臺上停留30 s后再放回籠中，此時潛伏期記為120 s。訓(xùn)練時依次從3個不同的入水點入水，每次入水點相同，訓(xùn)練的順序固定。此項主要訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和游泳能力。每天訓(xùn)練1次。

針康組：造模后進行頭穴叢刺法針刺法，并在留針期間進行Morris水迷宮訓(xùn)練，每天1次。

1.3.3 學(xué)習(xí)記憶能力的評估 Y-型迷宮：為一個三等臂式迷宮，每臂頂端設(shè)一信號燈，相應(yīng)臂的信號燈亮，此臂即為安全區(qū)，其余兩臂為危險區(qū)。訓(xùn)練中始終有一臂為安全區(qū)，安全區(qū)按無規(guī)則的次序變換。如果大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為正確，跑到暗臂則為錯誤。一天內(nèi)連續(xù)分段訓(xùn)練大鼠，每10次為1段，兩段間大鼠休息2 min。記錄大鼠掌握迷宮結(jié)構(gòu)(續(xù)10次測試中有9次正確即為掌握迷宮結(jié)構(gòu))所需的訓(xùn)練次數(shù)，訓(xùn)練次數(shù)越少表明大鼠學(xué)習(xí)能力越強。

1.3.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 治療14 d后，待大鼠檢測完行為學(xué)后灌注取材。按0.35 ml/100 g體重的劑量腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠深度麻醉后，打開胸腔充分暴露心臟，灌注針刺入心尖，經(jīng)左心室插管至主動脈，固定插管并剪開右心耳，灌注生理鹽水，直至右心耳流出澄清液體，再灌注4%多聚甲醛固定液200 ml。灌注完畢后，斷頭取腦，置于多聚甲醛中固定。24 h后常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm，采用免疫組化染色。

每張切片于10×40放大倍數(shù)下隨機選5個視野，統(tǒng)計每個視野內(nèi)的突觸素陽性細胞數(shù)，凡顯色者均為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls法進行Q檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力 Y-型迷宮實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，各組分辨學(xué)習(xí)能力下降(P＜0.05)。與模型組比較，頭穴叢刺組、康復(fù)組、針康組學(xué)習(xí)能力明顯恢復(fù)(P＜0.01)，且針康組優(yōu)于頭穴叢刺組和康復(fù)組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2 海馬突觸素的表達 局灶性海馬缺血灶周圍突觸素陽性細胞明顯增多，表現(xiàn)為神經(jīng)元軸突、樹突、細胞體中褐色深染。其中軸突表達最為明顯。與假手術(shù)組比較，各組大鼠的突觸素表達明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，康復(fù)組、針康組表達明顯增加(P＜0.01)，且針康組明顯優(yōu)于頭穴叢刺組和康復(fù)組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠突觸素檢測結(jié)果

3 討論

突觸素是一種位于突觸囊泡膜上鈣結(jié)合蛋白，是突觸小泡特異性外側(cè)膜蛋白，幾乎所有中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前終末內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有突觸素，在突觸囊泡轉(zhuǎn)運、排放及內(nèi)容物釋放過程中都發(fā)揮著重要作用。P38既是突觸發(fā)生的標(biāo)志[4-5]，又是突觸傳遞效能水平的反映[6]。P38除了影響突觸囊泡在前突觸末端的分布，還參與調(diào)節(jié)其他突觸生成時必需蛋白的生成，其機制可能是突觸素通過與肌動蛋白絲的結(jié)合，穩(wěn)定突觸囊泡，從而阻止這些蛋白的降解，因此，突觸素的可能作用是作為介導(dǎo)突觸形成信號通路中的上游分子。

針康法促進局灶性海馬缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機制可能有多種。電針結(jié)合運動療法可增加腦缺血中心區(qū)神經(jīng)生長因子的表達[7]，促進海馬齒狀回巢蛋白陽性細胞增殖[8]。孔妍等研究認為，針康法能提高缺氧缺血性腦損傷幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其分子機制可能與海馬CA1區(qū)海馬微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)陽性細胞表達增加有關(guān)[9]。趙振峰等將60例大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，頭穴叢刺組，康復(fù)組，針康組，采用光化學(xué)法誘導(dǎo)法制作海馬缺血模型，分別在3d、7 d、14 d進行Y-型迷宮測試，并觀察血管基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)的蛋白及其mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針康法能上調(diào)局灶性缺血大鼠海馬SDF-1 mRNA表達，認為這可能是其促進灶性海馬缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高的機制之一[10-11]。

本實驗結(jié)果顯示，局灶性海馬缺血大鼠在針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療后P38表達增強，與模型組、頭穴叢刺組、康復(fù)組比較有顯著性差異(P＜0.05)。提示針康法能夠上調(diào)腦缺血后海馬區(qū)P38表達，進而改善學(xué)習(xí)記憶功能。表明針康法能明顯促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力的改善，可能與其促進海馬神經(jīng)元突觸前囊泡的數(shù)量增加有關(guān)。

本實驗中針康組對腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改善，明顯優(yōu)于單純的頭穴叢刺組或康復(fù)組。表明針灸這一傳統(tǒng)康復(fù)療法與現(xiàn)代康復(fù)相結(jié)合在短時間內(nèi)，對于改善缺血大鼠神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于其他療法。其機制可能與其針刺運動訓(xùn)練促進局灶性海馬缺血大鼠患側(cè)海馬區(qū)P38蛋白表達有關(guān)。有實驗發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病患者，突觸素免疫反應(yīng)性在額葉皮質(zhì)和海馬顯著減少，并且與認知功能損害呈負相關(guān)[12]，且動物實驗也報道突觸素表達水平與空間記憶能力密切相關(guān)，突觸素表達較高的動物在Morris水迷宮測試中的成績更好[13]。

由于突觸形成和再生是多種因素相互作用的結(jié)果，此過程受很多種蛋白、因子表達變化的影響。

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