缺血性腦卒中血清低分子量蛋白質(zhì)的表達(dá)①

王屹，于艷，涂文軍，陳蕾，陳惠

目前，急性缺血性腦卒中的診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)和神經(jīng)影像學(xué)資料。實(shí)際上CT的作用有限。而MRI檢查價(jià)格昂貴、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)可能由于患者自身原因，如躁動(dòng)不安、有心臟起搏器或其他金屬植入物而無(wú)法進(jìn)行檢查，限制了MRI的廣泛使用。因而尋找快速簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)室血液檢查方法對(duì)于該疾病的早期診斷和早期干預(yù)具有十分重要的意義。有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道血清生物標(biāo)記物在診斷急性缺血性腦卒中的應(yīng)用價(jià)值。這些標(biāo)記物包括：髓磷脂堿基蛋白(MBP)、S100蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)等[1-2]。然而，到目前仍未找到臨床實(shí)用性強(qiáng)的血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)志[3]。

缺血性腦卒中的發(fā)生進(jìn)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，近年蛋白組學(xué)技術(shù)特別是質(zhì)譜技術(shù)為其診斷開拓了新的領(lǐng)域，復(fù)雜的蛋白表達(dá)模式將提供更多的信息，提高血清標(biāo)記物用于該疾病診斷的能力。基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)質(zhì)譜技術(shù)是過去30年蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域最重大的進(jìn)展，具有高靈敏性、高特異性、高通量和快速檢測(cè)的特點(diǎn)，可大大減少檢測(cè)的時(shí)間，利于早診斷、早治療。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于損傷和疾病早期診斷研究[4-5]。本研究旨在應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)尋找急性缺血性腦卒中患者與正常人之間的血清差異多肽，為急性缺血性腦卒中的早期診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例組 2011年1月～2011年9月北京博愛醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科急性缺血性腦卒中住院患者，選取缺血性腦卒中病例標(biāo)本45份，排除12份，33例入選病例組。其中男性15例，女性18例；年齡45～85歲，平均(68.18±12.86)歲；病程小于2周，平均5.8 d。由神經(jīng)科醫(yī)生根據(jù)中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010(中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì))[6]做出診斷，并經(jīng)CT或MRI證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①急性缺血性腦卒中：發(fā)病2周內(nèi)；②年齡＞40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出血性腦卒中；②顱腦創(chuàng)傷；③中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾??；④主要器官衰竭；⑤嚴(yán)重感染；⑥惡性腫瘤；⑦肝腎疾病。

1.1.2 對(duì)照組 39例同期來(lái)本院體驗(yàn)的正常健康者作為對(duì)照組。其中男性18例，女性21例；年齡55～92歲，平均(62.92±5.88)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞40歲；②常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦卒中；②顱腦創(chuàng)傷；③中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾??；④主要器官衰竭；⑤嚴(yán)重感染；⑥惡性腫瘤；⑦肝腎疾病。

兩組在年齡、性別方面無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 血清處理 病例組在出現(xiàn)腦卒中相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后取樣，對(duì)照組于安靜狀態(tài)取樣。均抽取靜脈血4 ml，分離血清，標(biāo)記并于-80℃保存。

1.3 試劑和儀器 乙腈、乙醇、三氟乙酸(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，色譜純)；α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CCA)基質(zhì)，弱陽(yáng)離子交換磁珠(MB-WCX)、MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀(autoflexTMspeedⅢ)、拋光384靶板和8位手動(dòng)分離磁架，均購(gòu)自布魯克?道爾頓公司。

1.4 方法 兩組均進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括血紅蛋白、血小板；血液生化檢查，包括總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和空腹血糖。

病例組依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分(the National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)卒中的嚴(yán)重程度，依據(jù)改良整體生活功能量表(modified Rankin Scale,mRS)評(píng)價(jià)功能恢復(fù)。記錄患者病例資料，包括既往高血壓、糖尿病、高血脂病史，是否吸煙等。

1.4.1 WCX磁珠捕獲血清蛋白質(zhì) 向含有活化磁珠的樣品管加5 μl血清，室溫靜置5 min，將樣品管放入磁珠分離器。使磁珠貼壁1 min，棄去懸浮的液體，加入100 μl磁珠清洗緩沖液，在磁珠分離器移動(dòng)樣品管10次后靜置，棄去懸浮的液體，加入5 μl磁珠洗脫緩沖液，獲得樣品洗脫液。取1 μl樣品洗脫液點(diǎn)在拋光384靶板上，同時(shí)在附近孔內(nèi)點(diǎn)加標(biāo)準(zhǔn)品1 μl，置于室溫至干燥，點(diǎn)加0.4 mg/ml HCCA基質(zhì)1 μl，室溫放置至干燥無(wú)液體殘留。將點(diǎn)好樣的靶板移至MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀的離子源中，樣本在51%激光能量下進(jìn)行解析和離子化，通過標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4.2 數(shù)據(jù)收集和分析 應(yīng)用FlexControl軟件，在正離子-線性模式下檢測(cè)病例組和對(duì)照組樣本，檢測(cè)的分子量范圍為1000～10000 Da，累加10個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)(1000 shots)，峰強(qiáng)度低于300的峰不累加，保存累加的圖譜。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過質(zhì)譜分析獲得的譜圖，使用ClinProTools軟件進(jìn)行峰的統(tǒng)計(jì)，尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異峰。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)統(tǒng)計(jì)資料的類型進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

病例組的高密度脂蛋白顯著低于對(duì)照組(P＜0.001)，空腹血糖水平高于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 病例組和對(duì)照組血液細(xì)胞學(xué)和生化檢測(cè)結(jié)果

兩組共獲得55個(gè)差異峰(P＜0.05)。分子量1000～2000 Da范圍中共有7個(gè)差異峰，包括4個(gè)正向增高的峰，3個(gè)反向差異峰，其中質(zhì)核比為1864的峰在病例組中水平降低明顯。見圖1。其中20份(60.6%)病例組血清未檢測(cè)到該峰。質(zhì)核比為1864的峰是一個(gè)兩組的反向差異峰。病例組中13份血清存在低水平的該峰，20份沒有檢測(cè)到該峰。

以是否檢測(cè)到該峰將病例組分為兩組，比較在年齡、性別、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙情況、血紅蛋白、血小板、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、損傷嚴(yán)重程度及臨床轉(zhuǎn)歸情況等方面的差異，結(jié)果表明，兩組間在腦卒中危險(xiǎn)因素、卒中的嚴(yán)重程度、功能恢復(fù)等方面無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表2～表4。

表2 病例組年齡、性別等危險(xiǎn)因素分布情況

表3 病例組血液細(xì)胞學(xué)和血液生化檢測(cè)結(jié)果

表4 病例組臨床特征

3 討論

蛋白組學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為有效篩選疾病標(biāo)記物提供了強(qiáng)有力的工具。自2002年以來(lái)，血清多肽組學(xué)已成功應(yīng)用于多種腫瘤的診斷研究，如乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等[4]；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病的蛋白標(biāo)記物的篩選和鑒定，在老年性癡呆、帕金森病、神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷[7-9]等疾病中已有報(bào)道。但較多采用液相色譜和雙向電泳的方法。

血清多肽譜分析在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用為人們利用質(zhì)譜技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中尋找血清蛋白組/多肽模式診斷帶來(lái)了希望。然而相關(guān)報(bào)道極少。2007年Inagaki等應(yīng)用超高效液相色譜法聯(lián)用電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-Electro Spray Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometry，UPLC-ESI-TOF-MS）技術(shù)分析大鼠的毛發(fā)，成功地從易卒中自發(fā)性高血壓大鼠的毛發(fā)找到卒中的潛在生物標(biāo)記物[10]。2008年Chizuru等在高血壓導(dǎo)致的腦卒中小鼠模型中使用表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(Surface-enhancedLaserDesorption/Ionization Time-Of-Fflight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)的方法得到3個(gè)差異多肽峰，并利用液相色譜的方法對(duì)其中一個(gè)蛋白進(jìn)行鑒定，顯示為結(jié)合珠蛋白，提示該蛋白與高血壓導(dǎo)致的腦卒中有關(guān)[11]。然而，上述技術(shù)常常出現(xiàn)重復(fù)性低的問題，不同的研究者使用相同的方法可能得到不同的血清多肽譜。

血清蛋白質(zhì)組中的低分子量區(qū)具有豐富的疾病診斷信息。在生物質(zhì)譜技術(shù)中，MALDI-TOF-MS技術(shù)在檢測(cè)低豐度蛋白時(shí)具有高靈敏性、高特異性、高通量和快速檢測(cè)的特點(diǎn)，MALDI-TOF質(zhì)譜儀5 min即可測(cè)試一個(gè)樣本，一臺(tái)儀器即可達(dá)到全年36000例的篩查通量，大大減少檢測(cè)的時(shí)間，利于早診斷、早治療。

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合弱陽(yáng)離子交換磁珠和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)33份缺血性腦卒中血清和39份正常對(duì)照血清進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，兩組共獲得55個(gè)差異峰(P＜0.05)，分子量 1000～2000 Da范圍中共有 7個(gè)差異峰，有4個(gè)正向增高的峰，有3個(gè)反向差異峰，其中質(zhì)核比為1864的峰在病例組中水平降低，甚至未檢測(cè)到。是否檢測(cè)到該峰與年齡、性別、血紅蛋白、血小板、總膽固醇、甘油三酯，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、腦卒中的嚴(yán)重程度、臨床轉(zhuǎn)歸情況等無(wú)關(guān)。因此，這個(gè)潛在的生物標(biāo)記物可作為缺血性腦卒中早期診斷的一個(gè)反向生物標(biāo)記物，其應(yīng)用不局限于病例組的特定亞群，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本結(jié)果是在相對(duì)較少樣本量的基礎(chǔ)上得出的，為尋找缺血性腦卒中早期診斷的血清生物標(biāo)記物，并最終確定其臨床實(shí)用價(jià)值，需要其一步加大樣本量進(jìn)行分析，對(duì)所獲得差異多肽或蛋白進(jìn)行純化、鑒定。通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而建立一個(gè)由單一或多個(gè)血清生物標(biāo)記物組成的早期診斷模型。

[1]Zimmermann-Ivol CG,Burkhard PR,Sanchez JC,et al.Fatty acid binding protein as a serum marker for the early diagnosis of stroke:a pilot study[J].Mol Cell Proteomics,2004,3(1):66-72.

[2]Anand N,Stead LG.Neuronspecific enolase as a marker for acute ischemic stroke:a systematic review[J].Cerebrovasc Dis,2005,20(4):213-219.

[3]Whiteley W,Tseng MC,Sandercock P.Blood biomarkers in the diagnosis of ischemic stroke:a systematic review[J].Stroke,2008,39:2902-2909.

[4]Villanueva J,Shaffer DR,Tempst P,et al.Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns[J].J Clin Invest,2006,116(1):271-284.

[5]Sriwanitchrak P,Viyanant V,Chaijaroenkul W,et al.Proteomics analysis and evaluation of biomarkers for detection of cholangiocarcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(6):1503-1510.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版),2010,2(4):50-59,69.

[7]Thambisetty M,Simmons A,Hye A,et al.Plasma biomarkers of brain atrophy in Alzheimer's disease[J].PLoS One,2011,6(12):e28527.doi:10.1371/journal.pone.0028527

[8]Pan S,Rush J,Zhang J,et al.Application of targeted quantitative proteomics analysis in human cerebrospinal fluid using a liquid chromatography matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometer(LC MALDI TOF/TOF)platform[J].J Proteome Res,2008,7(2):720-730.

[9]Jorg H,Magnus W,Per E,et al.Temporally resolved differential proteomic analysis of human ventricular CSF for monitoring traumatic brain injury biomarker candidates[J].J Neurosci Methods,2009,177:469-478.

[10]Inagaki S,Noda T,Min JZ,et al.Metabolic profiling of rat hair and screening biomarkers using ultra performance liquid chromatography with electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2007,1176(1-2):94-99.

[11]Chizuru K,Hiroaki S,Hirozo G,et al.Proteomic identification of haptoglobin as a stroke plasma biomarker in spontaneously hypertensive stroke-prone rats[J].Life Sci,2008,83:625-631.