紅樹林植物內(nèi)生放線菌I07A-01824發(fā)酵液中殺線蟲活性成分的分離、純化與鑒定

陶玲，旭格拉·哈布丁，韓寧寧，余生艷，閆蕾蕾，欒迎春，劉少偉，郭琳，蔣忠科，余利巖，孫承航

線蟲是線形動物門（Aschelminthes）線蟲綱（Nematoda）的一類蠕蟲動物。目前世界上對線蟲的關注主要包括三方面：首先是作為模式生物的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）。秀麗隱桿線蟲是生命科學領域研究十分深入的模式生物，因其具有細胞數(shù)目少、全身通透、含有大多數(shù)動物神經(jīng)系統(tǒng)的成分分子、基因組序列測序完成、生命周期短、遺傳背景清晰等特點，已成為現(xiàn)代發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、遺傳學、基因組學以及抗衰老研究的重要模式材料[1-5]。生命科學中很多基本問題的揭示，都得益于該模式生物的引入。其次是對植物造成嚴重損失的植物病害線蟲。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年由于線蟲危害引起的農(nóng)作物損失達 10%～15%[6-8]。三是對一系列能引起脊椎動物疾病的線蟲的研究，如腸蛔蟲、鉤蟲等。

由于秀麗隱桿線蟲在生命科學研究中的廣泛應用以及病害線蟲日趨嚴重的抗藥性問題[9-14]，本研究希望通過建立秀麗隱桿線蟲模型，發(fā)現(xiàn)新型的微生物來源的殺線蟲物質(zhì)，對生命科學的發(fā)展和抗線蟲劑的發(fā)現(xiàn)起到一定的推動作用。最終，本實驗以秀麗隱桿線蟲致死率為活性檢測方法，從紅樹林內(nèi)生放線菌 I07A-01824 的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到了具有良好殺線蟲作用的物質(zhì) 5,8-二烯十四酸，該微生物產(chǎn)物體外殺線蟲活性未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 紅樹林內(nèi)生放線菌 I07A-01824，分離自我國廣西山口紅樹植物木欖[Bruguiera gymnorrhiza (Linn.) Savigny]葉片，經(jīng)鑒定后確定其為黃白鏈霉菌（S.albidoflavus）[15]，在供試培養(yǎng)基上形成淺灰白色菌落，無可溶性色素生成[16]。目前保存于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所國家藥用微生物菌種保藏中心。

1.1.2 供試線蟲 秀麗隱桿線蟲及其培養(yǎng)方法由福建師范大學田寶玉老師提供。

1.1.3 層析材料及試劑 100～200 目柱層析正相硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品；RP-8柱層析反相硅膠、60GF254 分析型薄層色譜鋁箔硅膠板和制備型薄層色譜玻璃硅膠板為美國 Merck 公司產(chǎn)品；環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純，為北京化工廠生產(chǎn)；色譜甲醇為美國 Honeywell Burdick &Jackson 公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 紅樹林內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（YM 培養(yǎng)基）：酵母膏 0.4%，麥芽膏 1%，葡萄糖 0.4%，瓊脂 1.2%，pH 7.2；種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為 A2培養(yǎng)基：葡萄糖 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.5%，玉米漿 0.4%，可溶性淀粉 2%，黃豆餅粉 1%，CoCl20.02%，CaCO30.4%，pH 7.2。

1.1.4.2 線蟲培養(yǎng)基 燕麥培養(yǎng)基：燕麥 20 g，無菌水 70～80 ml；PDA 培養(yǎng)基。

1.1.4.3 線蟲培養(yǎng)液和裂解液 M9 緩沖液：Na2HPO4·12H2O 30.24 g/L，KH2PO46 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L；裂解液：1 mol/L NaOH∶10% NaClO∶雙蒸水 = 15∶1∶34。

1.1.5 主要儀器及設備 LC-20AT 高效液相色譜儀、LC-MS-IT-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀和UV-2201PC 分光光度計為日本 Shimadzu 公司產(chǎn)品；Apex-Qe-FTMS 質(zhì)譜儀為德國 Bruker 公司產(chǎn)品；VNS-600核磁共振儀為瑞士 Varian 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的發(fā)酵 紅樹林內(nèi)生放線菌I07A-01824 在斜面培養(yǎng)基上 28 ℃ 培養(yǎng) 10 d 左右，待菌體長滿斜面時挖塊接種于裝有 50 ml A2種子培養(yǎng)基的 250 ml 搖瓶中，于 28 ℃、180 r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 36 h。將 50 ml 種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入裝有1 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的 5 L 搖瓶中，相同條件培養(yǎng) 72 h，收獲。

1.2.2 次級代謝產(chǎn)物的分離、純化 將 10 L 菌株I07A-01824 的二級發(fā)酵液在 4475 × g 條件下離心 20 min。上清液用等體積乙酸乙酯萃取 2 次，有機相用少量無水 Na2SO4脫水后減壓濃縮得到油狀棕褐色粗提物。將粗提物進行 TLC 分離，展開劑為環(huán)己烷∶乙酸乙酯 = 1∶1。展開后按條帶刮下測活，活性條帶用 0.2 μm 的水系微孔濾膜過濾后，進 HPLC 制備柱進行分析、收集（色譜柱：9.4 mm× 250 mm，5 μm，YMC；流動相：80% 甲醇水溶液；流速：1 ml/min），制備得到化合物 I 純品。

1.2.3 線蟲模型構(gòu)建 為了保證計數(shù)的方便、準確和穩(wěn)定，在測活開始前，需對線蟲進行同齡化操作，使線蟲處于同一齡期。具體操作為：從活化培養(yǎng)基上洗下線蟲，加至 10 ml 的裂解液中，裂解15 min，在裂解的過程中不斷搖晃裂解液以保證線蟲裂解充分。隨后 2517 × g 離心 30 s，棄去上清，加入 10 ml 雙蒸水，充分混勻后再離心 30 s，重復 4～5 次，最后用 M9 緩沖液重復 1～2 次。裂解得到的線蟲卵加至長滿酵母的 PDA 平板上。25 ℃ 培養(yǎng) 36 h，即可得到處于二齡期的線蟲[17-20]。

1.2.4 活性測定 將 75 μl 的新鮮 M9 緩沖液加至 96 孔板，同時加入 20 μl 的線蟲液（20條/20 μl）。利用倍半稀釋法，將得到的化合物用甲醇稀釋，取 5 μl 加入 96 孔板，使終濃度分別為1750.0、875.0、437.5、218.8、109.4、54.7、27.3、13.7、6.8 mg/L，置于 25 ℃ 下培養(yǎng)。24 h 后觀察，蟲體僵直，振蕩器震蕩 30 s 仍僵直即判定為線蟲死亡，按公式：致死率 =（實驗組死亡數(shù) － 對照組死亡數(shù)）/實驗組死亡數(shù) × 100% 求得樣品的致死率。以未做任何處理的甲醇為陰性對照，同時將未接種的空培養(yǎng)基相同操作后進行測活，以排除培養(yǎng)基中組分對殺蟲活性的影響。再以樣品濃度為橫坐標，以致死率為縱坐標作圖，求出 LC50。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 I 為黃色油狀液體，HR-ESI-MS 數(shù)據(jù)表明其 (M-H)–測量值為 223.16911，理論值為223.16926，分子量為 224，分子式為 C14H24O2，不飽和度為 3。化合物 I 的1H-NMR 和13C-NMR數(shù)據(jù)見表 1。

表1 化合物 I 的 NMR 數(shù)據(jù)Table 1 NMR data of compound I in CDCl3

13C-NMR 數(shù)據(jù)及 DEPT 數(shù)據(jù)表明該化合物共有 14 個碳，包括 1 個羰基碳（δ 178.5）和4 個雙鍵叔碳（δ127.5，128.4，129.4，130.5），8 個仲碳和1 個伯碳（δ14.1）。由1H-1H COSY 和HMBC 譜學數(shù)據(jù)分析進一步確認了化合物 I 的結(jié)構(gòu)為 5,8-二烯十四酸（圖 1）。

圖1 5,8-二烯十四酸的結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Structure of tetradeca-5,8-dienoic acid

2.2 殺線蟲活性檢測

實驗結(jié)果表明，未接種的培養(yǎng)基濃縮物與甲醇對照均不具有殺死線蟲的作用?；衔?I 在27.3 mg/L 劑量下開始顯示出對秀麗隱桿線蟲有活性，結(jié)果見表 2。其 LC50值為 162.8 mg/L。

表2 不同濃度的化合物 I 對線蟲的致死率Table 2 The lethal rate of different concentrations

3 討論

從紅樹林內(nèi)生放線菌 I07A-01824 菌株中分離純化得到了具有較強殺線蟲活性的化合物 I，經(jīng)波譜技術分析，確定化學結(jié)構(gòu)為 5,8-二烯十四酸。實驗對未接種放線菌的培養(yǎng)基進行了線蟲測活，發(fā)現(xiàn)其對線蟲無作用，從而排除了該不飽和脂肪酸來自于培養(yǎng)基的可能性。此外，在菌株鑒定過程中，對菌株細胞壁的組成成分進行了胞壁分析[15]，未見含有 5,8-二烯十四酸的成分。

5,8-二烯十四酸對秀麗隱桿線蟲的 LC50值為 162.8 mg/L。目前較有效的殺線蟲劑阿維菌素和甲胺磷，其 LC50值分別為 0.0601 mg/L 和3282.46 mg/L，可見該化合物的殺線蟲作用雖然差于常規(guī)殺線蟲劑阿維菌素，但遠遠優(yōu)于甲胺磷[21]，而且近幾年線蟲對阿維菌素抗性的增強，使阿維菌素的殺線蟲作用大大減弱[22]。

不飽和脂肪酸殺線蟲作用機制主要可分為以下幾種：①去垢作用，即脂肪酸通過增溶作用干擾線蟲表皮或下皮，導致線蟲死亡；②脂肪酸通過與靶標質(zhì)膜的親脂區(qū)直接作用，殺死線蟲[23]；③通過抑制水和電解質(zhì)的吸收達到緩瀉性能從而發(fā)揮驅(qū)蠕蟲的功效（如蓖麻油）[24]；④有些不飽和脂肪酸是線蟲體內(nèi) δ12 脂肪酸脫飽和酶的抑制劑，可減少線蟲體內(nèi)雙不飽和亞油酸的含量，導致線蟲發(fā)育的停滯，甚至是死亡。5,8-二烯十四酸對于模式生物秀麗隱桿線蟲的作用機制尚不清楚，相關研究正在進行中。

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