綿羊血漿中多拉菌素的H P L C測(cè)定及其藥動(dòng)學(xué)研究

石艷麗，李 巍，韓彩霞，張子群，李曉云，宋銘忻

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100193；3.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，哈爾濱 150036）

多拉菌素（Doramectin，DRM）是20世紀(jì)90年代美國(guó)輝瑞公司研制開發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，DRM是一種阿維菌素的衍生物，經(jīng)過生物突變合成，在阿維菌素的C25上引入一環(huán)己烷而成，是一種最新的動(dòng)物體內(nèi)外廣譜抗寄生蟲藥[1-3]。DRM為高親脂類物質(zhì)，在動(dòng)物體內(nèi)具有分布廣、組織排除緩慢、生物半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)，因而生物利用率高[4-5]。其藥代動(dòng)力學(xué)特性受給藥途徑、藥物劑型、動(dòng)物種類和個(gè)體差異的顯著影響[6]。

本研究成功研制了多拉菌素澆潑劑，并經(jīng)臨床試驗(yàn)證明具有高效、廣譜、安全及使用方便等特點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究多拉菌素澆潑劑的作用特點(diǎn)，為臨床用藥提供理論依據(jù)，本文采用C18柱進(jìn)行樣品前處理與純化，HPLC測(cè)定樣品中多拉菌素的含量，對(duì)多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

多拉菌素原料藥（浙江海正藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)040801），純度：87.3%；多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，批號(hào)33993），純度：84.6%；N-甲基咪唑，99%；三氟醋酸酐，化學(xué)純（批號(hào)F20050926，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈及甲醇，色譜純（德國(guó)默克公司）；肝素（批號(hào)F20071010，上海山溏化工有限公司）。

1.2 動(dòng)物

健康綿羊6只，體重（30±0.48）kg，雌雄各半，試驗(yàn)前飼養(yǎng)觀察一周，給藥前12 h起禁食，自由飲水，采樣期間正常飼養(yǎng)。

1.3 儀器及色譜條件

安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Beckman）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Laborota 4003型（德國(guó)Heidolph公司）；真空抽氣泵，2XZ型（中國(guó)臨海市精工真空設(shè)備廠）；固相萃取柱：ODSC18柱(100 g·L-1)（中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所）；色譜柱：Kromasil KR100C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇（100%）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：475 nm；柱溫：30℃。

1.4 溶液配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取DRM的標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（色譜級(jí)）溶解并稀釋定容，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（250 μg·mL-1），置于4℃冰箱保存，使用時(shí)根據(jù)試驗(yàn)需要用甲醇（色譜級(jí)）配制到所需濃度。

1.4.2 衍生化試劑的配制

A液：N-甲基咪唑∶無水乙腈（1∶1，V/V）

B液：三氟乙酸酐∶無水乙腈（1∶2，V/V）

1.5 給藥與血樣采集

按照治療劑量0.5 mg·kg-1·bw-1多拉菌素澆潑劑涂擦于綿羊的兩耳及背部，并分別于給藥前及給藥后的2、4、6、8、12、24 h及2、3、4、5、6、7、9、11、14、17、20、24、28、35 d于綿羊頸靜脈采集血樣，10 mL·次-1，肝素抗凝并迅速置冰水中保存，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿并轉(zhuǎn)入另一離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 藥物提取及衍生化

取0.5 mL血漿樣品添加DRM標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋震動(dòng)1 min。加入5 mL乙腈，渦旋震動(dòng)混勻2 min，3 500 r·min-1離心5 min，取上清，重復(fù)兩次，合并上清液。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓蒸干，加入0.5 mL乙腈，渦旋震動(dòng)混勻，加入9.5 mL水，充分混勻，用C18固相萃取柱進(jìn)行純化。固相萃取程序：C18柱先用5 mL乙腈進(jìn)行洗脫，再用5 mL蒸餾水進(jìn)行淋洗，將樣品過C18柱，依次用1 mL甲醇，10 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，用氮?dú)庠?0℃沙浴中吹干，殘留物用100 μL N-甲基咪唑-乙腈溶液溶解，加入150 μL三氟乙酸酐-乙腈溶液混勻，靜置15～30 min，再加入750 μL無水甲醇終止反應(yīng)，待上機(jī)測(cè)定。

1.7 線性范圍與最低檢測(cè)濃度

取血漿樣品0.5 mL，加入多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使血漿中多拉菌素的濃度（C）分別為0.1、0.5、1、5、10、15、25、50、75、100 ng·mL-1，參照1.6法制樣，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，記錄色譜圖，得峰面積（A），每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，以A對(duì)C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，根據(jù)血漿和組織標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)估計(jì)樣品中多拉菌素定量的線性范圍。按信噪比≥3來確定DRM在血漿中的最低檢測(cè)濃度。

1.8 精密度及回收率的測(cè)定

分別配制含多拉菌素高、中、低（40、20、5 ng·mL-1）3種濃度的血漿樣品各3份，參照1.6方法操作，分別于同日內(nèi)及連續(xù)不同日測(cè)定，計(jì)算其日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)及該提取方法的回收率。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)運(yùn)用Marquardt法迭代擬合，通過對(duì)模型擬合的評(píng)價(jià)，根據(jù)AIC最小原則選出最佳模型，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)處理選用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)編制的3P97程序運(yùn)行，統(tǒng)計(jì)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離

在上述色譜條件下，DRM標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿、空白血漿添加藥物色譜圖見圖1～3。由圖譜可見，本試驗(yàn)所選用的分析條件可以較好地分離DRM，色譜圖基線平穩(wěn)，雜質(zhì)少，DRM與雜質(zhì)分離良好，色譜峰對(duì)稱性好，DRMB1a和B1b分離良好，保留時(shí)間適中（B1a為9.5 min)，表明DRM的HPLC檢測(cè)條件是比較理想的，從圖中可以看出，DRM在測(cè)定條件下與血漿成分分離良好。

圖1 多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of standard preparation of doramectin

圖2 空白血漿色譜Fig.2 HPLC chromatograms of blank plasma sample

圖3 含多拉菌素血漿色譜Fig.3 HPLC chromatograms of plasma containing doramectin

2.2 線性范圍與檢測(cè)靈敏度

多拉菌素在1～100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以A（峰面積）對(duì)C（血藥濃度）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.287x+0.431，R2=0.9985。最低檢測(cè)濃度為0.1 ng·mL-1。

2.3 精密度及回收率

結(jié)果見表1。

表1 綿羊血漿中多拉菌素的回收率及變異系數(shù)Table 1 Recovery rate and Variation coefficient of doramectin in sheep plasma

由表1可知，多拉菌素的回收率介于98.4%～101.5%之間，日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，表明本試驗(yàn)方法回收率高，準(zhǔn)確度高，符合藥代動(dòng)力學(xué)要求。

2.4 多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)

給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的綿羊血漿經(jīng)過樣品處理并進(jìn)行HPLC測(cè)定。給藥后35 d綿羊血漿中的DRM濃度均低于檢測(cè)線，藥時(shí)曲線見圖4。

圖4 綿羊血漿樣品中時(shí)間—多拉菌素平均濃度散點(diǎn)圖Fig.4 Graphic of mean doramectin concentrations distributed at distinct time points in sheep plasma

綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將試驗(yàn)所得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)3P97程序計(jì)算可知，綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后在體內(nèi)的過程符合二室模型，有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

表2 多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetics parameter of doramectin pour-on in sheep （n＝6）

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)單劑量（0.5 mg·kg-1BW）給綿羊背部澆注0.5%多拉菌素澆潑劑后，血漿中藥物濃度的消除半衰期（T1/2Kβ）為4.95 d，根據(jù)半衰期判斷，多拉菌素屬于慢性消除藥物，這與張萍等在犬上的動(dòng)力學(xué)研究（按照0.3 mg·kg-1BW皮下注射給藥，消除半衰期為4.78 d）[7]及張繼瑜等在豬上的藥動(dòng)學(xué)研究（按照0.3 mg·kg-1BW靜脈注射，消除半衰期為6.11 d）[10]結(jié)果較接近。本試驗(yàn)中多拉菌素在綿羊體內(nèi)的分布半衰期（T1/2kα）為1.89 d，較多拉菌素在犬皮下注射給藥時(shí)分布半衰期0.58 d及在豬靜脈注射給藥時(shí)分布半衰期1.09 d要大，說明0.5%多拉菌素澆潑給藥在綿羊體內(nèi)的分布相對(duì)其對(duì)犬皮下注射及豬靜脈注射的分布較慢，這主要與動(dòng)物的種屬差異和不同的給藥途徑有關(guān)。

藥時(shí)曲線下面積（AUC）反映進(jìn)入體循環(huán)藥量的多少，它是評(píng)價(jià)藥物吸收程度的一個(gè)重要指標(biāo)[8-9]。藥時(shí)曲線某一時(shí)間區(qū)段下的AUC反映該時(shí)間內(nèi)的體內(nèi)藥量，代表了一次給藥后的吸收總量，反映藥物被吸收的程度[11]。本試驗(yàn)條件下背部澆潑多拉菌素在綿羊體內(nèi)的AUC為（144.7±23.36）ng·d·mL-1，這與張萍等[7]皮下注射于犬上AUC值（187.43±24.99）ng·d·mL-1結(jié)果相接近，表明0.5%多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的吸收較好。

藥物經(jīng)血管外給藥吸收后的血藥濃度最大值稱為藥峰濃度（Cmax），與給藥劑量、給藥途徑、給藥次數(shù)、動(dòng)物種屬等有關(guān)。藥物達(dá)到峰濃度所需的時(shí)間即為藥峰時(shí)間（Tmax），取決于吸收速率和消除速率。兩者是反映藥物吸收快慢的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中背部皮膚澆潑多拉菌素于綿羊時(shí)的Cmax為（19.93±0.37）ng·mL-1，Tmax為（3.18±0.89）d與Lifschitz等皮下注射于牛上的Tmax值（3.86±1.11）d結(jié)果[12]相接近，表明多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)的吸收較快。

本試驗(yàn)選用AIC法對(duì)多拉菌素在綿羊體內(nèi)的房室模型進(jìn)行判定，即根據(jù)不同的AIC值，可以確定最佳模型。AIC值越小，則該模型擬合度越好，特別是當(dāng)兩種模型的殘差平方和值很接近時(shí)AIC值較小的模型是最適模型。本試驗(yàn)條件下測(cè)出的多拉菌素在綿羊體內(nèi)過程符合二室開放模型，這與張繼瑜等在豬體內(nèi)注射多拉菌素的研究結(jié)果[10]相同，而張萍等在犬上注射多拉菌素的動(dòng)力學(xué)模型為一室模型[7]，可見動(dòng)物種屬差異對(duì)藥物的動(dòng)力學(xué)特征是有影響的。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在動(dòng)物血漿中的動(dòng)力學(xué)特性可變性較大，這在牛試驗(yàn)中已得到證明[13]，本試驗(yàn)中多拉菌素在綿羊體內(nèi)的血漿濃度也存在著差異，該結(jié)果表明多拉菌素在動(dòng)物個(gè)體內(nèi)吸收和代謝的個(gè)體差異性，在相同的試驗(yàn)條件下，這種現(xiàn)象對(duì)伊維菌素在牛、豬、綿羊和山羊中同樣存在，這可能與動(dòng)物的體況、性別、年齡和生理狀況有關(guān)，但與藥物的固有特性關(guān)系不大[10]。

綜上，藥物配方組成或給藥途徑不同，可明顯影響藥物的吸收速率，進(jìn)而影響其生物半衰期和最大血藥濃度。多拉菌素澆潑劑在綿羊體內(nèi)血藥濃度較高，吸收分布迅速，可為臨床用藥提供依據(jù)。

[1] Goude A C,Evans N A,Gration K A F,et al.Doramectin,A potent novel endectocide[J].Vet Parasitol,1993,49(1):5-15.

[2] Bousquet-Melou A,Mercadier S,Alvinerie M,et al.Endectocide exchanges between grazing cattle after pour-on administration of doramectin,ivermectin and moxidectin[J].Int J Parasitol,2004,34(11):1299-1307.

[3] 高玉紅,郭照成,劉方悅,等.多拉菌素的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(4):141-144.

[4] Sallovitz J M,Lifschitz A,Imperiale F,et al.Doramectin concentration profiles in the gastrointestinal tract of topicallytreated calves:Influence of animal licking restriction[J].Vet Parasitol,2005,133(1):61-70.

[5] 高玉紅,路義鑫,石艷麗,等.多拉菌素澆潑劑臨床前毒理學(xué)試驗(yàn)研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(1):41-43.

[6]Mckellar Q A,Benchaoui H A.Avermectins and milbemycins[J].J Vet Pharmacol Therap,1996,19(5):331-335.

[7] 張萍,王加才,江善祥.多拉菌素在犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,22(3):389-392.

[8] Wen H Q,Pan B L,Yuwan Wang,et al.Plasma and milk kinetics of eprinomectin following topical or oral administra-tion to lactating Chinese Holstein cows[J].Vet Parasitology,2010,174:72-76.

[9] Dupuy J,Jean-Francois S,Alvinerie M,et al.Plasma and milk kinetic ofeprinomectin and moxidectin in lactating water buffaloes(Bubalus bubalis)[J].Vet Parasitology,2008,157:284-290.

[10] 張繼瑜,李劍勇,周緒正,等.豬肌肉注射多拉菌素的藥物動(dòng)力學(xué)研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(8):83-86.

[11] 劉超任.藥物制劑藥時(shí)曲線下的有效面積[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1993,24(9):400-401.

[12] Lifschitz A,Sallovitz J,Imperiale F.et al.Pharmacokinetic evaluation of four ivermectin generic formulations in calves[J].Vet Parasitol,2004,119(2-3):247-257.

[13] Nowakowski M,Lynch M,Smith D,et al.Pharmacokinetics and bioequivalence of parenterally administred doramectin in cattle[J].J Vet Pharmacol Therap,1995,18(4):290-298.