雞HOPX基因的克隆及表達(dá)分析

張 坤，張志威，王維世，閆曉紅，李 輝，王 寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

HOPX基因（Homeodomain only protein X）又名OB1（Odd homeoBox 1），其編碼的蛋白是一個非HOX家族蛋白，該蛋白非常小，僅有73個氨基酸殘基構(gòu)成[1]。與HOX家族蛋白不同，HOPX僅有一個非典型的同源異型結(jié)構(gòu)域（Homeodomain）。由于突變，該結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合DNA，而主要是參與蛋白間的互作。HOPX的作用取決于與其互作的蛋白[2]。目前已發(fā)現(xiàn)HOPX蛋白可與血清反應(yīng)因子（Serum response factor,SRF）[3-4]、組蛋白去乙?；?（HDAC2）[5]等發(fā)生蛋白互作。HOPX基因在的哺乳動物腦、胎盤、心臟、脾臟、肺臟、膀胱、平滑肌等多種組織和器官表達(dá)[6]。HOPX基因調(diào)控心臟發(fā)育[7-9]、平滑肌[10-12]、骨骼肌[13]、上皮角質(zhì)細(xì)胞[14-15]以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化[16]。很多有關(guān)癌癥的研究表明，HOPX基因是一個腫瘤抑制因子，HOPX基因啟動子的甲基化能導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌[17]，子宮內(nèi)膜癌[18]和胃癌的發(fā)生[19]，HOPX還是肺癌和絨毛膜癌的抑制因子[20-22]。對HOPX基因的功能和調(diào)控的研究，目前多集中于哺乳動物，禽類HOPX基因的相關(guān)研究尚未見報道。本實驗室的雞組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析及Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，HOPX基因在雞脂肪組織的表達(dá)量顯著高于其它組織。

為深入研究該基因在脂肪生長發(fā)育過程中的作用，本研究擴增和克隆雞HOPX基因全長的CDS區(qū)，對其進(jìn)行了序列分析，采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法，進(jìn)行該基因的組織表達(dá)譜分析、該基因在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雞脂肪組織發(fā)育過程中的表達(dá)差異分析以及在雞脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)分析。本研究為開展HOPX基因在脂肪生長發(fā)育過程中的作用及其作用機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

本研究實驗動物為10日齡商品AA肉仔雞和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂系雙向選擇品系第14世代肉雞。實驗雞按常規(guī)商品肉雞飼養(yǎng)程序進(jìn)行飼養(yǎng)。在無菌條件下，從1～12周齡的高、低脂系肉雞中，每周齡分別選取高、低脂系雞各5只，采集腹部脂肪組織，且7周齡時，同時采集腎臟（K），心臟（H），肝臟(L)，睪丸(Te)，脾臟(Sp)，十二指腸(D)，回腸(I)，空腸(J)，肌胃周圍脂肪(GF)，腹部脂肪(AF)，腺胃(P)，肌胃(G)，大腦(Cr)，胸肌(PM)和腿肌(LM)15種組織樣。

1.1.2 感受態(tài)細(xì)胞和克隆載體

大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞(購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)；克隆載體pMD-18T Vector(購自大連寶生物工程有限公司)。

1.1.3 試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量制備試劑盒(購自Axygen(杭州)有限公司)；瓊脂糖（Agarose）(購自北京原平皓生物技術(shù)公司)；內(nèi)切酶EcoRI和SacI、oligo dT引物、dNTP、Taq酶、RNase Inhibitor及SYBR Premix ExTaq試劑盒(均購自大連寶生物工程有限公司)；總RNA極速提取試劑盒(購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司)；DNA Marker(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；半定量RT-PCR試劑盒、RNase H2O(購自Promega公司)；DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液和I型膠原酶(購自GIBCO公司)。

1.1.4 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的HOPX基因（NM_204556）和GAPDH基因（K01458）的核酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，分別用于HOPX全長CDS區(qū)擴增以及HOPX基因和內(nèi)參基因的表達(dá)分析。引物由上海英駿（Invitrogen）生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HOPX基因PCR引物序列、退火條件及產(chǎn)物Table 1 Primer sequences,PCR product and annealing temperatures of chicken HOPX gene

1.2 方法

1.2.1 雞RNA提取和cDNA的制備

從1至12周齡，每周齡分別選取高、低脂系雞各5只，每個周齡屠宰一批肉雞，在無菌條件下，采取腹部脂肪組織，其中在7周齡時，同時還采取其他14種組織樣品。樣品迅速凍存于液氮中，然后再保存在-80℃冰箱中。采用總RNA提取試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司），提取脂肪組織等各組織樣的總RNA。cDNA制備的具體操作如下：分別取1 μg雞各組織總RNA，采用Oligo-dT引物，按照Promega提供的試劑說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成是總RNA 1 μg，Oligo-dT Primer 0.5 μL,RNAse Free Water 3.5 μL，ImProm-II Buffer 4 μL，MgCL22.5 μL,dNTP 1 μL,RNAse Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL,ImProm-II Reverse Transcriptase 1 μL,RNAse Water 6 μL,總體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為70℃5 min,冰浴5 min,25℃5 min，60℃60 min,70℃15 min。所得到的cDNA在-20℃保存。

1.2.2 雞HOPX基因CDS區(qū)的擴增、克隆和序列分析

以雞脂肪組織cDNA為模板，用引物GHOPX1（F和R）擴增HOPX的編碼區(qū)。反應(yīng)液的組成是ExTaq酶0.5 μL,10×Ex Taq Buffer 10 μL,dNTP 8 μL,cDNA 5 μL,上/下游引物（GHOPX1）各 2 μL，H2O 72.5 μL，總體系為 100 μL。 PCR 反應(yīng)條件是94℃ 5 min，30個循環(huán)（94℃ 30 s；55.3℃ 30 s；72 ℃30 s），72 ℃ 5 min。

將HOPX基因CDS區(qū)的擴增產(chǎn)物，采用凝膠回收試劑盒回收，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在平板培養(yǎng)基挑取單菌落，加入到含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，放于37℃搖床中過夜。用菌液PCR和雙酶切法鑒定。挑選陽性的克隆，送上海英駿（Invitrogen）生物技術(shù)有限公司測序，應(yīng)用ClusterW2.0(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行HOPX蛋白序列的同源性分析。

1.2.3 Real-time RT-PCR反應(yīng)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行HOPX基因mRNA表達(dá)量的定量分析。反應(yīng)液的組成是SYBR 5 μL，ROX 0.2 μL，上/下游引物(GHOPX2)各 0.2 μL，H2O 3.4 μL，cDNA 1 μL,總體系為 10 μL。反應(yīng)條件為95℃30 s，40個循環(huán)(95℃5 s；60 ℃ 25 s)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。GAPDH基因作為內(nèi)參基因，反應(yīng)液的組成及反應(yīng)條件同上述。用ABI 7500 Software軟件分析表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 半定量RT-PCR反應(yīng)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行HOPX基因的PCR擴增。反應(yīng)液組成為EasyTaq酶0.05 μL，上/下游引物（GHOPX2）各 0.2 μL，H2O 7.25 μL，cDNA 0.5 μL,10×Buffer 1 μL,dNTP 0.8 μL，總體系為10 μL。反應(yīng)條件為94℃5 min，23個循環(huán)（94 ℃ 30 s；55.3℃ 30 s；72 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。GAPDH基因作為內(nèi)參基因，退火溫度設(shè)為41.5℃，其余條件同上述。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和分化

取10日齡商品AA肉仔雞，無菌采取腹部脂肪組織，放入裝有PBS的平皿中，反復(fù)沖洗，盡量除去血管和筋膜，用眼科剪剪碎組織，隨即轉(zhuǎn)入含有膠原酶的消化液試管中，于37℃消化60 min（每5 min震蕩一次）。消化完畢，加入培養(yǎng)液終止消化，然后分別經(jīng)100目和600目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾。將濾液分裝入離心管，2 000 r·min-1離心10 min，除去培養(yǎng)液，用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，室溫孵育10 min后，2 000 r·min-1離心10 min，細(xì)胞沉淀，用培養(yǎng)液（DMEM/F12）洗1～2次，最后重懸細(xì)胞，獲得雞基質(zhì)-血管細(xì)胞（S-V細(xì)胞），即雞前脂肪細(xì)胞。

將分離的前脂肪細(xì)胞記數(shù)后，按1×105cells·mL-1左右的密度接種，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后，洗去未貼壁的細(xì)胞，再在培養(yǎng)液中加入油酸（160 μmol·L-1）誘導(dǎo)分化，以后每2 d換液1次。收集不同分化時間點細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用real-time RT-PCR分別檢測HOPX基因和GAPDH（內(nèi)參）基因的表達(dá)，引物見表1。采用2-△△Ct的方法計算HOPX基因mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HOPX基因全長CDS區(qū)的擴增、克隆及序列分析

HOPX基因CDS區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條240 bp特異性帶（預(yù)期的擴增片段上下游包括兩個酶切位點），與預(yù)期相符（見圖1）。膠回收PCR產(chǎn)物，采用pMD-18T載體克隆。陽性重組質(zhì)粒酶切鑒定如圖2所示，雙酶切獲得了預(yù)期大小的DNA片段。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫序列（NM_204556）一致，表明試驗已成功獲得雞HOPX基因。序列分析顯示，HOPX的CDS區(qū)全長222 bp，編碼73個氨基酸。SMART結(jié)構(gòu)域分析顯示,與人和鼠等的HOPX相似，雞HOPX也僅有一個非典型的HD結(jié)構(gòu)域，不能能結(jié)合DNA。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products corresponding mRNA coding chicken HOPX

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖譜Fig.2 Identification of the recombinant HOPX plasmid by double digestion

查詢EMBL數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/）共獲得雞HOPX蛋白的20個同源序列，這20個物種分別為火雞，牛、豬、人，大小鼠、豚鼠、熊貓、兔、獼猴、狨猴、大猩猩、長臂猿、大象、倉鼠、鴨嘴獸、三文魚、斑馬魚和河豚。多序列比對分析顯示，這些HOPX蛋白序列的在不同物種間的保守性較高，表現(xiàn)出物種間進(jìn)化關(guān)系越近，序列間相似度越高的規(guī)律（見表2）。

表2 雞與其他物種HOPX氨基酸序列同源性比較Table 2 Comparison of amino acid sequences of HOPXs from 20 different species

例如，人和大猩猩、長臂猿間；雞和火雞間；大鼠和小鼠間序列相似度均為100%。哺乳類牛、豬、人、鼠、大象、猿類、兔、大熊貓等序列相似度大于86%，斑馬魚與三文魚序列的相似度為86%，而雞與哺乳類HOPX蛋白的序列相似度在69%～79%間，與魚類的相似度則小于61%。

2.2 HOPX基因的表達(dá)分析

2.2.1HOPX基因在不同組織中的表達(dá)情況

以GAPDH基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）作為內(nèi)參基因，采用real-time RTPCR的方法，檢測HOPX基因在肉雞高，低脂系7周齡公雞的腎臟（K）、心臟（H）、肝臟(L)、睪丸(Te)、脾臟(Sp)、十二指腸(D)、肌胃周圍脂肪(GF)、 肌 胃 (G)、 腹 部 脂 肪 (AF)、 回 腸 (I)、 大 腦(Cr)、腿肌(LM)、胸肌(PM)、空腸(J)和腺胃(P)共 15種組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，HOPX基因在脂肪組織(腹部脂肪組織和肌胃周圍脂肪組織)的表達(dá)量最高。HOPX基因雖也在雞的其它多個組織有表達(dá)，但其表達(dá)量較低，尤其在胸肌、腿肌及腎臟表達(dá)量最低（見圖3），這與本實驗室早期表達(dá)譜芯片和Northern blot分析結(jié)果一致。進(jìn)一步比較HOPX基因在高、低脂系肉雞不同器官和組織中的表達(dá)情況，可見，在睪丸和脾臟組織中，低脂系雞HOPX基因的表達(dá)量顯著高于高脂系（P＜0.05）；在腿肌、心臟、肌胃組織中，低脂系雞HOPX基因的表達(dá)量極顯著高于高脂系（P＜0.01），而在空腸中，高脂系雞HOPX基因的表達(dá)極顯著地高于低脂系（P＜0.01）。除此之外，高、低脂系肉雞的其他供試組織中HOPX基因的表達(dá)量差異不顯著（見圖3）。

半定量RT-PCR方法的驗證如圖4所示，其結(jié)果與real-time RT-PCR的結(jié)果基本吻合。

圖3 雞HOPX基因在7周齡15種組織中的表達(dá)特性（real-time RT-PCR）Fig.3 Tissue expression characterization of HOPX gene in 7-week-old broilers of NEAUHLF(real-time RT-PCR)

圖4 雞HOPX基因在7周齡15種組織中的表達(dá)特性(半定量RT-PCR)Fig.4 Tissue expression characterization of the HOPX gene in 7-week-old broilers of NEAUHLF(semi-quantitation RT-PCR)

2.2.2HOPX基因在高、低脂系肉雞脂肪發(fā)育過程中的表達(dá)情況

HOPX基因在脂肪組織中高表達(dá)，提示HOPX基因在脂肪組織的生長和發(fā)育中發(fā)揮作用。為了解HOPX基因在脂肪生長發(fā)育中的作用，采用real-time RT-PCR方法，檢測HOPX基因在高、低脂系肉雞脂肪組織生長發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律及差異。結(jié)果顯示，隨著雞齡的增長和脂肪組織的生長發(fā)育，雞脂肪組織中，HOPX基因的表達(dá)呈上升趨勢；到7周齡時，HOPX基因在高、低脂兩系脂肪組織中表達(dá)量均略有下降，但之后又都持續(xù)上升；至9到12周齡時，HOPX的表達(dá)量趨于穩(wěn)定。高、低脂兩系間脂肪組織HOPX基因表達(dá)量的比較分析還表明，高脂系雞的脂肪組織中HOPX基因的表達(dá)量均高于低脂系中的表達(dá)量，且在2、3、5、6、10、12周齡時，HOPX的表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），在1、8、11周齡時，HOPX的表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01），在4、7、9周齡時差異不顯著（見圖5）。

圖5 雞HOPX基因在高、低脂雞脂肪組織發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律和差異（real-time RT-PCR）Fig.5 Tissue expression characterization of the HOPX gene in abdominal fat tissue of broilers of NEAUHLF(real-time RT-PCR)

2.2.3HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況

脂肪組織的生長發(fā)育包括細(xì)胞的增殖和分化。為了進(jìn)一步研究HOPX基因?qū)τ谥旧L發(fā)育的作用，我們檢測了HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖6。HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化初期表達(dá)量下降，但隨著脂肪細(xì)胞的分化，其表達(dá)上升，在細(xì)胞分化72 h，表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量下降。

圖6 HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律（real-time RT-PCR）Fig.6 Expression characterization of the HOPX gene in adipocyte differentiation(real-time RT-PCR)

3 討論與結(jié)論

本研究成功地克隆了雞HOPX基因的全長CDS區(qū)，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的mRNA序列一致。雞HOPX基因與其他物種HOPX基因的同源性很高，其中，與火雞的同源性達(dá)100%，與鼠和人HOPX基因的相似度達(dá)75%以上，預(yù)示在不同物種中HOPX基因的作用相似。結(jié)構(gòu)域分析顯示，與人和鼠等其他動物的HOPX相似，雞HOPX蛋白序列僅含有一個非典型HD結(jié)構(gòu)域，不能結(jié)合DNA，這表明HOPX作用機制相似，通過蛋白間的互作參與調(diào)控基因表達(dá)。

本實驗室早期組織表達(dá)譜芯片分析和Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，HOPX基因在雞脂肪組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織[23]，本研究的HOPX基因的組織表達(dá)分析顯示，HOPX基因在脂肪組織中高表達(dá)，HOPX基因雖然在其他組織也有表達(dá)，但遠(yuǎn)低于脂肪組織。研究表明，機體不同部位的脂肪組織存在異質(zhì)性，不同部位脂肪組織細(xì)胞的增殖能力、脂滴沉積能力、誘導(dǎo)凋亡的敏感性以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平都不同[24-26]，這可能是肌胃周圍脂肪組織和腹部脂肪組織HOPX基因表達(dá)量不同的原因。高、低脂雞脂肪組織表達(dá)分析顯示，高、低脂系雞的脂肪組織中，HOPX基因的表達(dá)存在顯著差異，表現(xiàn)為高脂系雞脂肪組織中的表達(dá)高于低脂系雞，提示HOPX可能參與脂肪的生長發(fā)育調(diào)控。HOPX基因在雞脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞分化程度的升高，HOPX基因的表達(dá)量逐漸增加，即分化程度高的脂肪細(xì)胞其HOPX基因的表達(dá)水平高。與低脂系雞相比，高脂系雞脂肪組織脂肪細(xì)胞的分化程度高，成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量多[27]，這可能是高脂系雞脂肪組織HOPX基因表達(dá)高于低脂系雞的原因。這些表達(dá)數(shù)據(jù)提示，HOPX基因在脂肪組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

對哺乳動物研究顯示，HOPX基因參與心臟發(fā)育、心肌細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞分化等的調(diào)控。目前尚未見HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化中的研究報道，本研究首次報道了HOPX基因在脂肪組織中高表達(dá)；HOPX基因在高、低脂系肉雞脂肪組織生長發(fā)育過程存在表達(dá)差異，且隨著脂肪細(xì)胞分化程度的升高，其表達(dá)量逐漸增加。HOPX基因在脂肪細(xì)胞分化中的作用及作用機制還不清楚，有待深入研究。

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