四君子湯加減顆粒對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及ND和IBD疫苗免疫效果的影響

張桂枝，羅永煌，侯春彬，靳雙星

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 北碚 400715；2.鄭州牧業(yè)工程高等專(zhuān)科學(xué)校畜牧系，河南 鄭州 450011；3.重慶市獸藥工程技術(shù)研究中心，重慶 北碚 400716）

近年來(lái)，由于病毒的變異、免疫抑制疾病的存在、不合理的疫苗接種以及應(yīng)激等因素，導(dǎo)致畜禽傳染病疫苗免疫效果不佳，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)、提高機(jī)體的免疫力、增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。中藥以其毒性低、副作用小、多靶點(diǎn)、病原微生物對(duì)其不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，尤其在免疫抑制性疾病和增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能方面中藥發(fā)揮著巨大的作用［1-5］。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓和甘草四味中藥組成，主治脾胃氣虛。本課題組依據(jù)畜牧生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床特點(diǎn)，將四君子湯中的人參改為具有明顯免疫增強(qiáng)作用的黃芪［6-7］，同時(shí)加入具有清熱解毒及免疫增強(qiáng)作用的板藍(lán)根、連翹［8-9］以及健脾消食的山楂和理氣消食的枳實(shí)，按處方中各藥所含有效成分的理化性質(zhì)，分別采取醇提、水提和蒸餾的方法，提取中藥有效組分，制備成中藥復(fù)方顆粒劑，考察其對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能以及肉用仔雞免疫雞新城疫（ND）疫苗、傳染性囊?。↖BD）疫苗后血清ND及IBD抗體效價(jià)的影響，旨在為獸醫(yī)臨床及生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 四君子湯加減顆粒的組成及制備 四君子湯加減顆粒由黃芪、白術(shù)、茯苓、甘草、板藍(lán)根、連翹、山楂和枳實(shí)組成。先用乙醇提取連翹的醇溶性有效組分。白術(shù)、枳實(shí)采用蒸餾法提取揮發(fā)油。連翹、白術(shù)和枳實(shí)的藥渣，與黃芪、茯苓、甘草、山楂、板藍(lán)根混合，水煎2次，合并水煎液濃縮至比重1.10（溫度60℃），加入乙醇沉淀水溶性組分中的雜質(zhì)，濾液與連翹的醇提液混合，經(jīng)濃縮制備流浸膏，再與一定量的蔗糖粉混合制軟材，制濕顆粒，干燥，整粒，最后將白術(shù)、枳實(shí)的揮發(fā)油噴灑在整粒后的顆粒表面，適度混勻、陰干即得（1g顆粒相當(dāng)于原生藥1.4g）。

1.1.2 主要試劑 ND Clone-30疫苗、ND-LaSota油乳劑滅活苗、ND標(biāo)準(zhǔn)濃縮抗原、ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；IBD凍干苗、IBD標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原、IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清等。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，體重18～20g。1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞，隔離飼養(yǎng)至所需日齡，選取360只發(fā)育均勻的健康雞供試驗(yàn)用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定［10］將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組為對(duì)照組，正常飲水；第2、3、4組為試驗(yàn)組，飲水中分別加入0.3%、0.6%、0.9%的四君子湯加減顆粒，連用5d。試驗(yàn)前4d，每只小鼠每天腹腔注射1次6%可溶性淀粉肉湯1mL。第5天，給小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1mL；30min后，再給小鼠腹腔注射1mL生理鹽水并輕柔腹部；20min后脫頸法處死小鼠，用注射器吸取腹腔液少許制成薄推片。瑞士染色鏡檢，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)／巨噬細(xì)胞總數(shù)×100；吞噬指數(shù)＝巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)／吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 雞血清中ND和IBD抗體效價(jià)的測(cè)定

1.2.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 選取7日齡、10日齡和14日齡的非免疫健康雞各120只。各日齡雞只分別分為4組，每組30只，第1組為對(duì)照組；第2、3、4組為試驗(yàn)組，免疫的同時(shí)，飲水中分別加入0.3%、0.6%、0.9%四君子湯加減顆粒，連用3周。每組隔離飼養(yǎng)，各組雞的飼料成分及飼養(yǎng)管理方式完全相同。

1.2.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物處理 7日齡4組雞按2羽份／只點(diǎn)眼、滴鼻 ND Clone-30疫苗，在免疫前、14、21日齡及28日齡，各組分別隨機(jī)抽取7只雞，采血，分離血清測(cè)定ND抗體效價(jià)。10日齡4組雞頸部皮下注射N(xiāo)D油乳劑滅活苗0.3mL／只，在免疫前、17、24日齡及31日齡，各組分別隨機(jī)抽取7只雞，采血，分離血清測(cè)定ND抗體效價(jià)。14日齡4組雞按2羽份／只滴口IBD疫苗，在免疫前、21、28日齡及35日齡，各組分別隨機(jī)抽取7只雞，采血，分離血清測(cè)定IBD抗體效價(jià)。

1.2.2.3 血清中ND抗體效價(jià)的測(cè)定 采用微量紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)測(cè)定，抗體效價(jià)的高低用血清陽(yáng)性最高稀釋倍數(shù)（nlog2）表示。

1.2.2.4 血清中IBD抗體效價(jià)的測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散沉淀反應(yīng) （AGP）測(cè)定，抗體效價(jià)的高低用血清陽(yáng)性最高稀釋倍數(shù)（nlog2）表示。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四君子湯加減顆粒對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 由表1可見(jiàn)，小鼠飲用四君子湯加減顆粒后，試驗(yàn)組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第3、4兩組均顯著高于第2組（P＜0.05）。第3、4兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 四君子湯加減顆粒對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.2 四君子湯加減顆粒對(duì)ND Clone-30疫苗免疫效果的影響 由表2可見(jiàn)，免疫前（即7日齡）各組的ND抗體效價(jià)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。免疫后的3個(gè)日齡階段，第3、4兩組的抗體效價(jià)均顯著高于第2組和對(duì)照組（P＜0.05），第3、4兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 四君子湯加減顆粒對(duì)ND Clone-30疫苗免疫效果的影響

2.3 四君子湯加減顆對(duì)ND油乳劑滅活疫苗免疫效果的影響 由表3可見(jiàn)，免疫前（即10日齡）各組的ND抗體效價(jià)無(wú)顯著差異（P＞0.05），免疫后的3個(gè)日齡階段，試驗(yàn)組的ND抗體效價(jià)均高于對(duì)照組，但在第17日齡，第2組抗體效價(jià)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。第3、4兩組的ND抗體效價(jià)顯著高于第2組和對(duì)照組（P＜0.05）。第3、4兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 四君子湯加減顆粒對(duì)ND油乳劑滅活疫苗免疫效果的影響

2.4 四君子湯加減顆粒對(duì)IBD疫苗免疫結(jié)果的影響 由表4可見(jiàn)，免疫前（即14日齡）各組的IBD抗體效價(jià)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在28日齡和35日齡試驗(yàn)組的IBD抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第 3、4 兩 組 顯 著 高 于 第 2 組 （P＜0.05），第3、4兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

四君子湯加減顆以益氣健脾和胃為主，兼以清熱解毒、消導(dǎo)理氣。其中黃芪、白術(shù)補(bǔ)中益氣，茯苓健脾利水，板藍(lán)根、連翹清熱解毒兼有扶正作用，枳實(shí)行氣，山楂健脾消食，甘草調(diào)和諸藥。

表4 四君子湯加減顆粒對(duì)IBD疫苗免疫結(jié)果的影響

現(xiàn)代免疫學(xué)研究證明，動(dòng)物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞在維持機(jī)體自身穩(wěn)定中起重要作用，巨噬細(xì)胞既能特異性地吞噬多種病原微生物，也能有效地清除體內(nèi)損傷、衰老、死亡的細(xì)胞，還能殺傷腫瘤細(xì)胞，并且有處理和傳遞抗原信息的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的應(yīng)答機(jī)能參與體內(nèi)的免疫，因此，對(duì)巨噬細(xì)胞的檢測(cè)是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中以淀粉肉湯培養(yǎng)液刺激小鼠腹腔，能提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)率和純度；以雞紅細(xì)胞作為抗原，具有體積大、特征顯著，易于識(shí)別等優(yōu)點(diǎn)，可較準(zhǔn)確地鑒定巨噬細(xì)胞的吞噬作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯加減顆粒能夠提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，發(fā)揮扶正祛邪的作用。

體液免疫是由抗原刺激B淋巴細(xì)胞，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞活化、增殖與分化，形成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，抗體效價(jià)的變化反映了機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯加減顆粒分別與ND Clone-30疫苗、N D油乳劑滅活苗和IBD凍干苗合用，均可使雞血清ND和IBD抗體效價(jià)高于或顯著高于對(duì)照組，顯示出四君子湯加減顆?？擅黠@增強(qiáng)這3種疫苗的免疫效果。

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