8種中藥多糖及其硫酸化衍生物對(duì)新城疫病毒的影響

王春花，金秧敏，張燕華，李春艷，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157041；3.浙江大學(xué)，浙江 杭州 310058）

新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、高度接觸性的禽類烈性傳染病，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害，至今對(duì)于該病的治療仍無(wú)有效的藥物。研究表明，中藥多糖可影響NDV感染作用，但目前并無(wú)多糖藥物應(yīng)用于臨床治療新城疫病毒性疾病，這除了由于體內(nèi)外試驗(yàn)差異因素導(dǎo)致外，還可能是由于中藥中所含的有效活性多糖含量低或中藥多糖本身藥效低，使多糖臨床治療效果不足，報(bào)道顯示，硫酸化修飾的方法可改變多糖的抗病毒活性。本試驗(yàn)選取含多糖成分并具有抗病毒活性的中藥為研究對(duì)象，提取多糖，通過(guò)氯磺酸-吡啶法硫酸化修飾多糖，以雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）為平臺(tái)，通過(guò)體外細(xì)胞篩選出高活性的抗NDV多糖，為多糖藥物的研究及防治新城疫病毒性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與病毒 中藥黃芪，大黃，牛膝，板藍(lán)根，當(dāng)歸，甘草，黃精，紫草，均購(gòu)自哈爾濱世一堂藥店；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；F48E9新城疫病毒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室提供；9周齡SPF雞胚由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 中藥多糖和硫酸化多糖的制備［1］采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取中藥多糖，硫酸化吡啶法硫酸化修飾多糖，多糖和硫酸化多糖溶液進(jìn)行190～500 nm區(qū)間紫外可見(jiàn)光連續(xù)吸收掃描，比較修飾前后吸收峰變化。

1.3 多糖及硫酸化多糖抗NDV活性測(cè)定 雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［2］，選擇均勻、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種倍比稀釋NDV病毒液，培養(yǎng)，觀察記錄，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算TCID50值。

設(shè)定兩種加藥方式，先加100μL多糖作用12 h，再加100μL病毒吸附2h組與先病毒吸附2h后作用多糖組，作用多糖濃度見(jiàn)表1～8，作用100TCID50病毒濃度為10-4.56，測(cè)定多種多糖對(duì)新城疫病毒的影響，每個(gè)藥物每種濃度4個(gè)孔，所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)。

CPE、OD值及選擇指數(shù)（selection index，SI）比較法綜合評(píng)價(jià)抗病毒效果，SI＝最大無(wú)毒濃度／最小有效濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸化多糖效果 多糖和硫酸化多糖紫外吸收峰比較看出，8種多糖經(jīng)氯磺酸-吡啶法硫酸化修飾的多糖出現(xiàn)新的吸收峰位于260～300nm，表示硫酸酯化多糖已合成。

2.2 多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用數(shù)據(jù) 8種多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用結(jié)果見(jiàn)表1～8，顯示8種多糖均具有一定抗病毒活性，以黃芪多糖效果最明顯，治療指數(shù)達(dá)8，當(dāng)歸多糖、板藍(lán)根多糖次之，紫草及黃精多糖效果不顯著，治療指數(shù)低于2。硫酸化修飾后當(dāng)歸和大黃多糖的抗病毒活性提高，治療指數(shù)高達(dá)16，表現(xiàn)強(qiáng)抗NDV作用?？共《拘Ч容^結(jié)果見(jiàn)圖1，顯示8種多糖及其硫酸化修飾物作用的NDV感染后細(xì)胞，細(xì)胞OD值都高于病毒對(duì)照組，說(shuō)明中藥多糖對(duì)NDV有一定的干擾作用。圖中1組先加多糖組均高于2組后加多糖組數(shù)據(jù)，說(shuō)明多糖對(duì)新城疫的干擾作用主要來(lái)自對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，只能抑制病毒的擴(kuò)散而不能直接殺傷NDV。

3 討論

目前體外細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定方法主要包括細(xì)胞病變抑制法、pH值轉(zhuǎn)變法、染色法與蝕斑降低法［3-4］，根據(jù)測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本試驗(yàn)采用CPE抑制法與MTT染色相結(jié)合的方法，在CPE觀察的基礎(chǔ)上初步判定所選成分的抗病毒活性，然后采用MTT染色法，對(duì)所選成分的抗病毒活性的大小進(jìn)行定量測(cè)定。既克服了CPE法主觀性強(qiáng)，不能定量分析的缺陷，又通過(guò)觀察細(xì)胞的CPE，決定進(jìn)行MTT測(cè)定的最適時(shí)間，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

試驗(yàn)顯示，多糖成分對(duì)新城疫病毒感染的細(xì)胞都有一定的影響作用，與胡元亮等人［5］試驗(yàn)得出結(jié)論相符。其中以黃芪和板藍(lán)根效果最好，治療指數(shù)可達(dá)8，其中關(guān)于大黃多糖，紫草多糖，黃精多糖抗NDV作用未見(jiàn)報(bào)道。

表1 牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

表3 板藍(lán)根多糖和硫酸化板藍(lán)根多糖各組細(xì)胞CPE與OD值的變化

表4 當(dāng)歸多糖和硫酸化當(dāng)歸多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

表5 黃精多糖和硫酸化黃芪多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

表6 大黃多糖和硫酸化大黃多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

表7 紫草多糖和硫酸化紫草多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

表8 甘草多糖和硫酸化甘草多糖各組細(xì)胞CPE和OD值的變化

圖1 多糖抗新城疫病毒作用柱狀圖

試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗NDV作用比較低的牛膝多糖、大黃多糖和當(dāng)歸多糖經(jīng)硫酸化修飾后其對(duì)NDV抑制作用顯著增強(qiáng)，此趨勢(shì)與鄭民實(shí)等［6］報(bào)道的多糖修飾上硫酸根后活性增強(qiáng)結(jié)論一致，說(shuō)明通過(guò)硫酸化修飾可使多糖抗NDV活性增強(qiáng)，但試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖和甘草多糖經(jīng)修飾后活性反而降低，分析原因可能為部分有效多糖在劇烈的化學(xué)反應(yīng)中被破壞，導(dǎo)致抗新城疫病毒活性降低。

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著加藥方式的不同，多糖及硫酸化多糖的抗病毒活性有差異性。先加藥物后接種病毒的目的是觀察多糖能否進(jìn)入細(xì)胞或吸附于細(xì)胞表面，以阻止病毒的吸附與侵入，先接種病毒后加多糖的目的是觀察藥物能否對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放［7］。多糖抗NDV作用比較顯示，1組先加多糖組均高于2組后加多糖組數(shù)據(jù)，說(shuō)明多糖對(duì)NDV的干擾作用主要來(lái)自對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，只能抑制病毒吸附與侵入，而不能對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒起作用，抑制其生物合成，成熟釋放或直接殺滅NDV。

［1］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999.

［2］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.3版.北京：科學(xué)出版社，1997.

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