點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖體外抗氧化活性的研究*

史振霞，吳智艷

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000）

點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus）又名黃花松茸、栗殼牛肝菌，是真菌門（Enmycophyta）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycolina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目 （Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、粘蓋牛肝菌屬（Suillus）的一種珍稀的食、藥兼用真菌[1]。點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌營(yíng)養(yǎng)成分全面且含量高，具有較好的醫(yī)療保健作用，其具有的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、提高人體免疫力等功效來源于多種生理活性物質(zhì)，如多糖、維生素、礦物質(zhì)等，其中以點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖的研究為重點(diǎn)[2]。真菌多糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的另一種有待深入研究的生物大分子，具有良好的生理調(diào)節(jié)作用，可以從根本上提高人體免疫力，起到強(qiáng)身保健的功能，因而具有廣泛應(yīng)用前景。

自由基與許多病理生理現(xiàn)象，如衰老、腫瘤、心血管疾病和炎癥等有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)，對(duì)保健品開發(fā)具有積極的作用[3，4]。本實(shí)驗(yàn)使用在河北燕山山區(qū)采集的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌，通過熱水浸提、乙醇沉淀等方法，對(duì)子實(shí)體粗多糖進(jìn)行提取，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖的抗氧化活性進(jìn)行驗(yàn)證，以抗氧化劑Vc作為陽性對(duì)照，以測(cè)定點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖對(duì)活性氧自由基·O2-、·OH的清除能力和還原能力，并研究點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖的抗氧化活性大小與其濃度的關(guān)系，為全面開發(fā)利用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌在醫(yī)藥、食品和保健品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus），采集于河北燕山山區(qū)平泉縣遼河源國(guó)家級(jí)森林公園。

1.2 多糖提取

稱取已干燥至恒重的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體6 g，在提取溫度為95℃，處理時(shí)間3.5 h，料液比1∶40條件下浸提子實(shí)體多糖，3000 r·min-1離心10 min，上清液即多糖提取液。在多糖提取液中加入3倍體積95%的乙醇沉淀多糖，冷凍干燥后得點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖。

1.3 點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖的脫蛋白

乙醇沉淀后的粗多糖類物質(zhì)中含有一定的蛋白質(zhì)，按上清液體積∶Sevag試劑體積4∶1的比例加入Sevag試劑，磁力攪拌器攪拌30 min，4000 r·min-1、20 min的條件下離心，取上清液，透析、乙醇沉淀、冷凍干燥后得點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖。

1.4 樣品中總糖的測(cè)定

蒽酮比色法測(cè)定樣品中總糖的含量[4-9]。

1.5 樣品中還原糖的測(cè)定

3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定樣品中還原糖含量[9]。

1.6 樣品中多糖含量的測(cè)定

多糖的含量＝總糖含量－還原糖含量。

1.7 粗多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.7.1 粗多糖對(duì)·OH的清除作用

采用Fenton體系測(cè)定點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖對(duì)·OH的清除作用，即利用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生·OH，由于·OH可特異地使番紅褪色，根據(jù)褪色程度用比色法來衡量·OH 的含量[9]。

反應(yīng)體系中加入0.15 mol·L-1pH7.4磷酸緩沖液1.5 mL，番紅花紅（濃度 260 mg·L-1） 0.2 mL，0.56 mmol·L-1EDTANa2-Fe(Ⅱ)0.7 mL（新鮮配制），再加入不同濃度的多糖液0.8 mL，最后加入1%H2O20.8 mL（新鮮配制），混勻后于37℃水浴保溫 30 min，3000 r·min-1離心5 min，取其上清液，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值[5]。空白組以磷酸緩沖液代替樣品溶液，對(duì)照組以磷酸緩沖液代替樣品溶液和EDTANa2-Fe(Ⅱ)溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率（E1）表示，計(jì)算公式如下：

公司主導(dǎo)完善評(píng)價(jià)體系、拓展發(fā)展通道，加大基層站區(qū)長(zhǎng)對(duì)職工評(píng)價(jià)的話語權(quán)、思想政治工作主動(dòng)權(quán)；公司主導(dǎo)搭建關(guān)愛平臺(tái)、建設(shè)站區(qū)文化，提升基層站區(qū)長(zhǎng)關(guān)愛職工的親和力、思想政治工作感染力。

E1=（A樣品-A空白） /（A對(duì)照-A空白） ×100%

式中：A樣品為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗糖液吸光度值；A空白和A對(duì)照分別為空白組和對(duì)照組吸光度值。

1.7.2 粗多糖對(duì)·O2-的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[10]，在堿性條件下，鄰苯三酚能夠自氧化產(chǎn)生·O2-和有色中間產(chǎn)物（在320 nm處有最大吸收峰），·O2-又對(duì)自氧化起催化作用，依據(jù)有色中間產(chǎn)物生成量的多少可判斷·O2-生成量的多少。加入一定量的多糖液可對(duì)·O2-產(chǎn)生不同的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致吸光度值的變化[11]。

取6 mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液，移至試管中，加入一定濃度的多糖樣品0.5 mL，37℃溫浴10 min，最后加入37℃預(yù)熱過的7 mmol·L-1鄰苯三酚鹽酸溶液 1 mL，混勻，精確反應(yīng)4 min，立即用0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)[12]，測(cè)320 nm處吸光度值[13]。對(duì)照組以Tris-HCl緩沖液代替糖液?？瞻捉M以Tris-HCl緩沖液代替糖液和鄰苯三酚鹽酸溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率（E2）表示，計(jì)算公式如下:

E2=(A對(duì)照-A樣品)/(A對(duì)照-A空白) ×100%

式中：A樣品為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖液吸光度值；A空白和A對(duì)照分別為空白組和對(duì)照組吸光度值。

試驗(yàn)采用Oyaizu法，通過觀察在多糖存在時(shí)，F(xiàn)e3+-Fe2+的轉(zhuǎn)移來檢測(cè)其還原能力。取1.0 mL不同濃度的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖液，移至試管中，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）以及2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后將該體系置于50℃恒溫水浴中恒溫20 min，然后加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，混合均勻，置于離心機(jī)內(nèi)3000 r·min-1離心10 min。移取2.5 mL上清液于另一試管中，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定體系的吸光度[14-16]，吸光度值越大說明多糖的還原能力越強(qiáng)[13]。

2 結(jié)果分析

2.1 總糖、還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

蒽酮比色法測(cè)定總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.03876+7.90571x，r=0.99815；3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.03671+2.16257x，R=0.99647。

2.2 粗多糖對(duì)·OH的清除作用

采用Fenton體系測(cè)定粗多糖對(duì)·OH的清除作用，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)，多糖濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)能達(dá)到最大清除率（98.95%），而后隨著多糖濃度的增加而變化不大。而Vc在濃度為0.02 mg·mL-1時(shí)清除率為80%，可見多糖對(duì)·OH的清除能力很強(qiáng)。

2.3 粗多糖對(duì)·O2-的清除作用

粗多糖對(duì)·O2-的清除效果見圖2。

由圖2可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，多糖濃度越高，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也越高，而后隨著多糖濃度的增加變化不太明顯。多糖濃度為10 mg·mL-1時(shí)能達(dá)到最大清除率（21.68%），而Vc在濃度為10 mg·mL-1時(shí)清除率為97.69%，可見與Vc相比點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖對(duì)·O2-的清除作用不太明顯。

2.4 粗多糖的還原能力

點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖的還原能力見圖3。

由圖3可知，點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖有一定的還原能力，且還原能力隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)，多糖濃度（x，mg·mL-1）與還原能力（y，%）之間的回歸方程為：y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過用熱水浸提點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體，乙醇沉淀多糖Sevag法去除多糖中的蛋白，并采用Fenton體系、鄰苯三酚自氧化法、Oyaizu法測(cè)定了點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖對(duì)·OH、·O2-的清除能力和還原能力，為新藥或保健食品開發(fā)研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

研究表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖具有較好的抗氧化活性，具有很強(qiáng)的還原能力，對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用，當(dāng)多糖濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大清除率98.95%，而對(duì)超氧陰離子的清除作用不太明顯，當(dāng)多糖濃度為10 mg·mL-1時(shí)其最大清除率為21.68%，而在相同條件下Vc濃度為10 mg·mL-1時(shí)，其清除率為97.69%，點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌多糖的還原能力良好且還原能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)， 多糖濃度（x,mg·mL-1）與還原能力（y，%）之間的回歸方程為y=0.03004+0.00996x，R=0.98841。試驗(yàn)結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌粗多糖具有一定的抗氧化活性，尤其對(duì)其清除·OH的活性值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

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