重組人體干細(xì)胞因子的表達(dá)、復(fù)性、純化及其對(duì)臍帶血干細(xì)胞體外擴(kuò)增作用研究

范 潔,丁欣欣,蔣永平,2

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院蘇州方舟生物醫(yī)藥研發(fā)中心,江蘇蘇州,215126;2.蘇州方舟基因藥業(yè)有限公司,江蘇蘇州,215126)

在需要造血干細(xì)胞的相關(guān)臨床治療中,骨髓移植作為造血干細(xì)胞(HSC)的來(lái)源之一,是目前應(yīng)用比較廣泛的治療手段[1]。胎兒臍血(UCB)中含有大量的造血干細(xì)胞,另外,新生兒的造血干細(xì)胞其增殖潛力更強(qiáng),生命周期及端粒更長(zhǎng)[2]。單份UCB中HSC絕對(duì)數(shù)量較少,無(wú)法滿足臨床需求。因此要促進(jìn)UCB的應(yīng)用首先要解決UCB體外擴(kuò)增的問題[3]。CD34蛋白多表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞表面,CD34+細(xì)胞具有集落形成能力和強(qiáng)大的增殖能力。因此,需要對(duì)CD34+細(xì)胞群體加以體外擴(kuò)增培養(yǎng),以獲得大量的具有分化潛能的HSC[4]。適量干細(xì)胞因子(SCF)與其他細(xì)胞因子聯(lián)用可對(duì)HSC進(jìn)行有效的體外擴(kuò)增[5]。目前國(guó)內(nèi)SCF原核表達(dá)多采用熱誘導(dǎo)表達(dá)或表達(dá)分泌型蛋白,具有一系列缺陷,本實(shí)驗(yàn)采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲取包涵體,可有效提高SCF表達(dá)量,同時(shí)減少因溫度不易控制而造成的表達(dá)量不理想等問題,為重組人體干細(xì)胞因子(rhSCF)的臨床研究及HSC的體外擴(kuò)增應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)rhSCF的E.coli BL21工程菌由Genscript公司制備;新生兒臍帶血標(biāo)本來(lái)自于蘇州九龍醫(yī)院及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科,所采臍血均征得患者同意。

1.2 方法

1.2.1 rhSCF蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化:將成功轉(zhuǎn)化了表達(dá)質(zhì)粒pET43.1a-SCF的E.coli BL21接種于100 μ g/mL氨芐西林的 2×YT培養(yǎng)液,搖菌、離心沉淀、超聲裂菌、再離心、去離子水洗后獲得包涵體。將包涵體攪拌并稀釋后透析。純化復(fù)性后的rhSCF,存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 純化蛋白的凝膠分析:對(duì)rhSCF包涵體及純化后的rhSCF的SDS-PAGE圖像進(jìn)行光密度掃描和圖像分析。

1.2.3 蛋白序列測(cè)定:采用Edman降解法,對(duì)純化后的樣品N端10個(gè)氨基酸進(jìn)行測(cè)序,以確認(rèn)所獲樣品是rhSCF。

1.2.4 從臍帶血中提取CD34+細(xì)胞:將新鮮臍帶血稀釋混勻,利用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離單核細(xì)胞。按照操作說(shuō)明進(jìn)行,每1×108個(gè)單核細(xì)胞加入300 μ L分選緩沖液、100 mL FcR阻斷劑、100 μ L微珠標(biāo)記抗 CD34抗體,4 ℃孵育 30 min,10 mL緩沖液洗滌后離心棄上清,5 mL緩沖液重懸細(xì)胞,分離裝置獲得CD34+細(xì)胞。

1.2.5 rhSCF在臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增中的作用:根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果,SCF 200 ng/mL+血小板生成素(TPO)50 ng/mL+FLT-3配體(FL)200 ng/mL為細(xì)胞擴(kuò)增最佳組合,將分選所得的細(xì)胞均分為9組,每組3個(gè)孔,接種于24孔板中培養(yǎng),初始細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔。9組分別為:PC 1組(標(biāo)準(zhǔn)品SCF 200 ng/mL+TPO 50 ng/mL+FL 200 ng/mL),NC1組(無(wú)細(xì)胞因子),SCF 0組、SCF 1組、SCF 2組、SCF 3組、SCF 4組、SCF 5組、SCF 6組均加入 TPO 50 ng/mL+FL 200 ng/mL,同時(shí)SCF 0～6組分別加入樣品 rhSCF 0、50 、100 、200 、300、400 、500 ng/mL 。于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃條件下培養(yǎng) 1周,細(xì)胞計(jì)數(shù),流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞比例。

1.2.6 流式分析:取適量待檢測(cè)細(xì)胞,用含1%BSA PBS洗滌并計(jì)數(shù),離心棄上清,按細(xì)胞數(shù)加入適量抗人CD34-PE單抗或同型免疫球蛋白G1(IgG1),避光常溫孵育15 min后洗滌1次,加入 350 μ L PBS 重懸細(xì)胞,BeckmanCoulterTMFC 500流式檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 rhSCF誘導(dǎo)表達(dá)及純化

復(fù)性純化并濃縮后的rhSCF濃度為0.5 g/L。經(jīng)過(guò)離子交換柱和凝膠過(guò)濾等過(guò)程后,蛋白獲得了較好的純化,圖中無(wú)明顯肉眼可見雜蛋白條帶,見圖1。

(列1:非誘導(dǎo)菌;列 2:誘導(dǎo)菌;列3:rhSCF包涵體;列4:純化rhSCF)

2.2 rhSCF圖像的光密度掃描及凝膠分析

對(duì)圖1進(jìn)行光密度掃描,同一本底條件下,rhSCF包涵體中目的蛋白純度達(dá)到79%,純化后rhSCF中目的蛋白純度達(dá)95%以上。

2.3 蛋白序列測(cè)定

經(jīng)上?；瞪锛夹g(shù)有限公司對(duì)純化蛋白N端10個(gè)氨基酸進(jìn)行測(cè)定,所獲結(jié)果與目的rhSCF序列相一致。證明所獲蛋白確為rhSCF。

2.4 rhSCF在臍血CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增中的作用

NC1組缺少細(xì)胞因子,CD34+細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行體外擴(kuò)增,1周后鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部死亡;SCF0組TPO與FL聯(lián)用,CD34+細(xì)胞培養(yǎng)1周后有少量擴(kuò)增;SCF 1-5組rhSCF、TPO和FL聯(lián)用,細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著提高并呈現(xiàn)與 rhSCF劑量相關(guān)關(guān)系,當(dāng)rhSCF濃度達(dá)到200 ng/mL時(shí)增殖倍數(shù)達(dá)到最高,之后細(xì)胞增殖倍數(shù)略有下降并維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平,見圖2。同PC1組SCF標(biāo)準(zhǔn)品相比,純化獲得的rhSCF在相同濃度下細(xì)胞增殖倍數(shù)無(wú)顯著差異(置信區(qū)間為95%,P=0.305),同時(shí)所有加入了細(xì)胞因子的組均同NC1組存在著差異(P<0.05),見表1。本實(shí)驗(yàn)室以標(biāo)準(zhǔn)品rhSCF作為變量檢驗(yàn)不同濃度rhSCF對(duì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響,見圖3。(本部分?jǐn)?shù)據(jù)尚未公開發(fā)表)

圖2 CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增與rhSCF和標(biāo)準(zhǔn)品SCF的劑量關(guān)系

表1 rhSCF和標(biāo)準(zhǔn)品rhSCF對(duì)CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增效果( x±s)

圖3 以標(biāo)準(zhǔn)品rhSCF在臍帶血體外擴(kuò)增倍數(shù)與rhSCF濃度的關(guān)系

3 討 論

由于HSC本身易分化的特點(diǎn),在對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)要抑制其分化是目前要解決的主要問題[6]。SCF原核表達(dá)多采用熱敏感啟動(dòng)子,但其在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中溫度不易控制,同時(shí)分泌型SCF表達(dá)量偏低,由于蛋白本身可溶,純化不易,通常需通過(guò)添加特殊氨基酸標(biāo)簽幫助純化,但這樣又會(huì)影響蛋白生物活性,而且產(chǎn)品不可直接用于人體。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)包涵體途徑純化蛋白,由于包涵體不可溶,蛋白易純化,通過(guò)一套通用的離子交換層析和凝膠過(guò)濾系統(tǒng)即可完成蛋白復(fù)性純化全過(guò)程,此方法不影響蛋白生物活性,可直接獲得并應(yīng)用高復(fù)性率高純度的rhSCF,同時(shí)包涵體表達(dá)量高并且穩(wěn)定,更適于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[7]。

本研究CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí),當(dāng)未添加任何細(xì)胞因子時(shí),細(xì)胞無(wú)法存活;而TPO 50 ng/mL、FL 200 ng/mL與一定濃度的SCF聯(lián)用時(shí)[8],這3種細(xì)胞因子聯(lián)用具有顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果 。實(shí)驗(yàn)中,在SCF濃度由0逐漸上升為500ng/mL時(shí),細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)首先有顯著提升,并隨SCF質(zhì)量濃度升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,在SCF濃度為200 ng/mL時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到最大。這與之前本實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)品SCF進(jìn)行體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)的結(jié)果吻合。但是當(dāng)SCF濃度在200 ng/mL以上進(jìn)一步增加時(shí),CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)不再隨蛋白濃度升高而升高,相反有輕微下降,提示CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)對(duì)SCF的劑量依賴關(guān)系存在臨界點(diǎn),由于細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞表面SCF受體數(shù)量是不變的,因此推測(cè)當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊竭_(dá)臨界點(diǎn)時(shí),蛋白與細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合趨于飽和。所以當(dāng)?shù)鞍诐舛冗M(jìn)一步增加時(shí),蛋白介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)并不會(huì)隨之增強(qiáng),而且由于蛋白分子增加,空間位阻效應(yīng)會(huì)影響蛋白與受體的結(jié)合,因此細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)會(huì)有一定程度的降低。同時(shí),在相同的質(zhì)量濃度下,樣品SCF與標(biāo)準(zhǔn)品組的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異,說(shuō)明復(fù)性純化后獲得的rhSCF具有良好的生物活性。

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