用紫外分光光度儀對缺血修飾白蛋白進(jìn)行掃描檢測

何樂春 張蓓

1 重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心 (重慶 401147)

2 重慶市醫(yī)療器械質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心 （重慶 401121）

3 重慶市計量質(zhì)量檢測研究院 （重慶 401121）

0.前言

缺血修飾白蛋白(IMA)是一種新的較為理想的缺血標(biāo)志物，它是第一個被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)銷售的心肌缺血標(biāo)志物。利用白蛋白-鈷結(jié)合試驗(yàn)檢測缺血修飾白蛋白含量，作為檢測早期心肌缺血的指標(biāo)。多方面研究證明，IMA可敏感地反映心肌缺血狀況，在急性冠狀動脈綜合征的早期診斷、危險分層、指導(dǎo)治療等方面有重要意義，是目前較為理想的檢測心肌缺血的生化標(biāo)志物。

1.試驗(yàn)過程

1.1 缺血修飾白蛋白檢測試劑盒說明

上海微銀生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的缺血修飾白蛋白檢測試劑盒[滬食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20061411號]，批號為11060150。

試劑盒里試劑為雙試劑，主要組成成分：R1（氯化鈷溶液 CoCl2·6H2O）、R2（偶氮顯色劑）。

1.2 試驗(yàn)原理

正常對照組血清樣品中的白蛋白以活性形式存在，在和R1已知過量的鈷離子溶液混合后，混合液中未與白蛋白結(jié)合的鈷離子的數(shù)量較少；而缺血病人含有較多的缺血修飾白蛋白（IMA），由于IMA與鈷離子結(jié)合的能力弱，混合液中存在較多數(shù)量的未與白蛋白結(jié)合的鈷離子，然后加入R2偶氮顯色劑顯色，缺血病人比正常對照組顏色深。在650nm或最接近650nm處檢測樣品的吸光度，所得數(shù)值與IMA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，即可得出IMA值。

1.3 操作說明

1.3.1 試驗(yàn)依據(jù)：采用缺血修飾白蛋白（IMA）檢測試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 試劑：

a) 空白試劑：試劑盒里現(xiàn)有的配套使用的空白試劑。

b）應(yīng)用試劑：按說明書配制，R1:R2=1:10

c）試驗(yàn)試劑：質(zhì)控血：R1:R2＝1:1:10

1.3.3 試驗(yàn)儀器：紫外分光光度儀（TU-1901）

1.3.4 試驗(yàn)步驟

1.3.4.1 分別以空氣、空白試劑、應(yīng)用試劑調(diào)零，在190nm～900nm對試驗(yàn)試劑進(jìn)行掃描，檢出特征吸收峰（谷）；

1.3.4.2 分別以空氣、空白試劑、應(yīng)用試劑調(diào)零后，按照產(chǎn)品說明書中的比色條件（光徑1cm，波長650nm）：測定試驗(yàn)試劑的OD值，平行測定3次。

2.試驗(yàn)結(jié)果

2.1 以空氣、空白試劑、應(yīng)用試劑調(diào)零，檢出試驗(yàn)試劑的特征吸收峰（谷）分別為580nm、586nm、646nm，光圖譜分別見圖1、圖2、圖3。

2.2 試驗(yàn)試劑的OD值（見表1）。

表1.

圖1.

圖2.

圖3.

3.對試驗(yàn)結(jié)果的分析

3.1 從特征吸收峰（谷）的光譜圖（圖1～圖3）可看出，圖1檢出的特征吸收峰為580nm，圖2檢出的特征吸收峰為586nm，即以空氣調(diào)零和以空白試劑調(diào)零所檢出的特征吸收峰完全一樣，而以應(yīng)用試劑調(diào)零檢出的光譜圖，其特征吸收峰為545nm，谷為646nm，與圖1、圖2相比校，光譜圖存在差異，一是峰值相差35～41nm，二是有波谷的出現(xiàn)。

3.2 從表1得出，以空氣和空白試劑分別調(diào)零后所得出的OD值幾乎一樣，兩者與以應(yīng)用試劑調(diào)零后所得出的OD值完全不一樣。圖3會出現(xiàn)波谷（646nm），以及在650nm的OD值為負(fù)值，皆因?yàn)榉磻?yīng)原理是顯色劑結(jié)合了剩余的鈷離子（即以R1和R2發(fā)生反應(yīng)后的吸光度值A(chǔ)1來調(diào)零，測定質(zhì)控血里的白蛋白和R1發(fā)生反應(yīng)后，R1中剩下的鈷離子與R2發(fā)生反應(yīng)所得的吸光度值A(chǔ)2，因A1＞A2，所以A2為負(fù)值）。

4.結(jié)束語

現(xiàn)目前市場上生產(chǎn)的缺血修飾白蛋白（IMA）檢測試劑盒的原理大致相同，主要基于白蛋白鈷結(jié)合試驗(yàn)，但由于試劑盒主要成分（大多為CoCl2?6H2O、顯色劑等）的配比及試驗(yàn)環(huán)境（即酸堿性）的不同，使得不同的生產(chǎn)廠家對其測定波長的設(shè)定有所不同，分別有470nm、505nm、510nm等。

此次試驗(yàn)的目的，第一，通過紫外分光光度儀檢出特征吸收峰（谷）；第二，按試劑盒說明書的要求，在指定波長下檢測吸光度，比較吸光度的差異。對圖1和圖2進(jìn)行比較，可看出，從吸收峰（580nm/586nm）到650nm這一波長范圍內(nèi)，吸光度是呈下降趨勢，企業(yè)將試驗(yàn)試劑吸光度呈下降趨式中的某一點(diǎn)（650nm）設(shè)置為檢測波長，不知意義何在，為何不直接將檢測波長設(shè)置在特征吸收峰的波長范圍內(nèi)，且企業(yè)在做該產(chǎn)品的研發(fā)時，是否做過相關(guān)性試驗(yàn)的對比及研究。比較圖2與圖3，用不同的試劑調(diào)零，得出的光譜圖完全不一樣，由此可得出試劑盒里現(xiàn)有的配套使用的空白試劑與應(yīng)用試劑的成分有差別。根據(jù)試驗(yàn)操作的平行原則，筆者認(rèn)為在消除試驗(yàn)空白時，應(yīng)以應(yīng)用試劑來消除試驗(yàn)空白，而不是以空氣或空白試劑來消除空白；按照產(chǎn)品說明書的檢驗(yàn)要求，雖整個試驗(yàn)過程都是平行操作進(jìn)行，但通過試驗(yàn)證明，用不同的方式進(jìn)行測試，所得的試驗(yàn)結(jié)果完全不同，而這種存在差異的結(jié)果是否能為臨床醫(yī)生提供真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)，又是否會影響到IMA在臨床上的診斷意義呢？

[1]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 26124-2011臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）[S].2011。

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