HPLC 法測(cè)定人血漿中比阿培南的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

王寶龍，蘭婷，李明華，李穆瓊，張俊娜，李曉曄#，丁莉坤（.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安7003；.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 7003）

比阿培南是一種碳青霉稀類合成抗生素[1]，對(duì)革蘭陰性及革蘭陽(yáng)性需氧菌和厭氧菌等均具有超廣譜強(qiáng)效抗菌作用[2]，且較少發(fā)生其他β-內(nèi)酰胺類抗生素常見的細(xì)菌耐藥性問題[3]；在臨床上常用于治療成人腹腔、下呼吸道和尿路感染，成為近些年來臨床上治療細(xì)菌感染常用藥物。因此，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[4～6]建立一種高效、穩(wěn)定、方便、快捷的檢測(cè)血漿中比阿培南的方法，并測(cè)定其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括G1312A二元泵、G1314B紫外檢測(cè)器、工作站（美國(guó)Agilent公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SartoriusBT25S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥

注射用比阿培南（山東兗州希爾康泰制藥有限公司，規(guī)格：每支0.3 g，批號(hào)：080228）；比阿培南對(duì)照品（山東兗州希爾康泰制藥有限公司，批號(hào)：080228，含量：99.6%）；內(nèi)標(biāo)：5-羥基吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140737-200501，含量：97.8%）；0.9%氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080 815-2M，規(guī)格：100 mL）；甲醇為色譜純，冰乙酸為分析純。

2 方法

2.1 受試者選擇

30名健康受試者，男、女各半，年齡（34.2±3.1）歲，身高（168.5±7.1）cm，體重（63.2±6.1）kg；試驗(yàn)前經(jīng)病史詢問、體檢、胸透、心電圖、血及尿常規(guī)、血生化檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均正常，受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史及其他慢性病史。受試前2周及試驗(yàn)期間未服用任何其他藥物，受試期間禁煙、酒及其他含咖啡因、茶堿等飲料，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。所有受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.2 給藥方法

30名健康受試者，隨機(jī)分配為低、中、高（150、300、600 mg）3個(gè)單劑量組，每組10例，男、女各半。試驗(yàn)前進(jìn)清淡晚餐后禁食12 h，于試驗(yàn)當(dāng)日用0.9%氯化鈉注射液分別溶解注射用比阿培南150、300、600 mg，靜脈滴注1.0 h。其中，300 mg劑量組的受試者在第1次給藥后進(jìn)行多次給藥試驗(yàn)，給藥劑量均為300 mg/次（方法同單劑量），q12h，連續(xù)給藥5 d。

2.3 試驗(yàn)溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液：準(zhǔn)確稱取比阿培南對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，并用混合溶液（水∶甲醇＝97∶3）定容至刻度線，得濃度為1.0 mg·mL－1的貯備液。再用混合溶液依次稀釋成濃度為100 、10 、1 μg·mL－1的比阿培南對(duì)照品溶液。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取5-羥基吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL棕色容量瓶，以混合溶液（水∶甲醇＝97∶3）定容至刻度線，振搖得濃度為1.0 mg·mL－1的5-羥基吲哚乙酸溶液。再用上述混合液稀釋至濃度為0.1 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 血樣采集

2.4.1 單劑量給藥樣品采集：于給藥前0 h，開始給藥后15、30、45 min及1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、7 h時(shí)由側(cè)前臂靜脈取血5 mL/人，置無菌肝素抗凝的試管中，離心分離出血漿置無菌試管中，于－20℃保存。

2.4.2 多劑量給藥樣品采集：于第2、3、4、5天早晨給藥前及第5天早晨給藥后30 min及1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、7、9、11 h時(shí)采集血樣，樣品處理方法同單劑量給藥。

2.5 血藥濃度測(cè)定

2.5.1 色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Bonus-RP（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.3%醋酸水溶液（B，梯度洗脫程序：0～4.2 min，98%；4.21～10 min，35%；10.01～15 min，98%）；流速為1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm。

2.5.2 血漿樣品處理：精密吸取血漿200 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋10 s，加7%硫酸鋅水溶液100 μL ，渦旋3 min，離心（16 000 r·min－1）5 min，定量吸取上清液200 μL，取20 μL進(jìn)樣分析。

2.5.3 專屬性考察：采用“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，分別考察了空白血漿、血漿中加入內(nèi)標(biāo)及給藥后受試者的血漿樣品色譜圖，結(jié)果，比阿培南的保留時(shí)間約為4.1 min，峰形良好。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.給藥后受試者血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.5-羥基吲哚乙酸；2.比阿培南Fig 1 HPLC ChromatogramsA.blank plasma B.blank plasma+internal standard；C.plasma sample after administration+internal standard；1.5-hydroxyindoleacetic acid；2.biapenem

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取空白血漿200 μL，分別加入濃度為0.001、0.01、0.01、0.1、0.1、0.1、1.0 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液40、10、20、6、20、40、10 μL，配制成血漿樣品濃度為 0.2、0.5、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0 μg·mL－1，按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜。以比阿培南濃度（X）為橫坐標(biāo)，比阿培南與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程為：Y＝0.000 461 9X－0.005 603 1（r＝0.999 9），結(jié)果表明比阿培南血藥濃度在0.2～50 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg·mL。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取空白血漿200 μL，加入0.01、1.0 mg·mL－1的比阿培南對(duì)照品溶液10、8 μL，配制成含比阿培南濃度為0.5、40.0 μg·mL－1的血漿樣品，置－20 ℃冰箱中保存。分別在0、6、12、18、24 h及2、3、4 d室溫解凍，按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，代入當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定比阿培南濃度，結(jié)果表明樣品在－20℃放置3 d內(nèi)穩(wěn)定。再取同樣濃度的樣品，置－20℃冰箱中保存12 h后取出，經(jīng)過3次反復(fù)凍融，每次6 h，按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果表明，經(jīng)過反復(fù)凍融后，樣品濃度下降。

2.5.6 精密度試驗(yàn)：精密吸取空白血漿200 μL，加入0.01、0.1、1.0 mg·mL－1的比阿培南對(duì)照品溶液10、10、8 μL，配制成含比阿培南濃度分別為0.5、5.0、40.0 μg·mL－1的血漿樣品各5份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定3 d。以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，求得日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.5.7 提取回收率試驗(yàn)：精密吸取空白血漿200 μL，按“2.5.6”項(xiàng)下方法加入比阿培南對(duì)照品溶液，配制成含比阿培南濃度為0.5、5.0、40.0 μg·mL－1的血漿樣品各5份。按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算比阿培南與內(nèi)標(biāo)的色譜面積之比（fs）。另取空白血漿200 μL，按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，取血漿上清液200 μL，再如上述方法加入比阿培南對(duì)照品溶液，精密配制成含比阿培南濃度為0.5、5.0、40.0 μg·mL－1的溶液5份，測(cè)定峰面積，計(jì)算比阿培南與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比（fr）。按fs/fr×100%計(jì)算，結(jié)果該方法的提取率高于85%，詳見表1。

2.5.8 方法回收率試驗(yàn)：精密吸取空白血漿200 μL，按“2.5.6”項(xiàng)下方法加入比阿培南對(duì)照品溶液，配制成含比阿培南濃度為0.5、5.0、40.0 μg·mL－1的血漿樣品各5份。按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣并測(cè)定峰面積，計(jì)算比阿培南與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比（fr），將所得結(jié)果代入當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即得實(shí)測(cè)濃度，以實(shí)測(cè)濃度除以理論濃度，即得方法回收率，結(jié)果見表1。

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度測(cè)試結(jié)果

受試者血漿樣品按“2.5.2”項(xiàng)下方法操作，每批樣品測(cè)定之前均制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在測(cè)定時(shí)隨機(jī)分配含比阿培南濃度為0.5、5、40 μg·mL－1的質(zhì)控樣品，計(jì)算樣品和質(zhì)控樣品的濃度，根據(jù)質(zhì)控樣品的測(cè)定結(jié)果決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍。30名受試者的平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 健康受試者靜脈滴注比阿培南后的平均血-時(shí)曲線A.單劑量；B.多劑量Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of biapenemin healthy volunteers after intravenous dripping of biapenemA.single dose；B.multiple dose

3.2 藥動(dòng)學(xué)研究

以受試者的經(jīng)時(shí)血藥濃度計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，比阿培南在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)呈二室模型。30名健康受試者靜脈滴注比阿培南后的各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

表2 受試者靜脈滴注比阿培南后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of biapenemin healthy volunteers after intravenous dripping（±s ）

表2 受試者靜脈滴注比阿培南后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of biapenemin healthy volunteers after intravenous dripping（±s ）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 單劑量給藥高中t1/2/h tmax/h cmax/mg·L-1 AUC0～12 h/mg·h·L-1 AUC0～∞/mg·h·L-1低1.13±0.16 1.02±0.21 9.04±4.24 18.17±3.86 20.42±4.69 1.06±0.10 1.10±0.31 17.64±4.55 36.44±7.68 37.21±7.63 1.11±0.12 1.05±0.27 35.10±4.23 70.24±8.91 72.40±9.03多劑量給藥1.07±1.35 1.04±0.60 19.61±3.68 32.47±3.90 33.36±3.80

4 討論

目前，國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)本藥的血藥濃度測(cè)定方法較多，但效果不好。本試驗(yàn)在初期選用流動(dòng)相時(shí)，嘗試過不同比例的甲醇（乙腈）∶水、甲醇（乙腈）∶磷酸鹽緩沖液、甲醇（乙腈）：冰乙酸等多種流動(dòng)相，由于比阿培南的強(qiáng)親水性，最終確定使用親水性Agilent Zorbax Bonus-RP柱（250 mm×4.6 mm，5μm），采用梯度洗脫的方式，先將有機(jī)相的比例調(diào)整至2%，等比阿培南在洗脫后，再加大有機(jī)相的比例，使內(nèi)標(biāo)在9.6 min洗脫，經(jīng)比較表明，在本試驗(yàn)條件下，比阿培南與血漿內(nèi)源性雜質(zhì)、內(nèi)標(biāo)均能很好地分離，分離度高。

在沉淀樣品過程中，采用多種常用的血漿沉淀劑進(jìn)行沉淀，如乙腈[4]、高氯酸[5]、三氯乙酸、冰乙酸、硫酸銨、硫酸鋅、甲醇，提取率試驗(yàn)結(jié)果表明，采用7%硫酸鋅水溶液沉淀時(shí)，能同時(shí)將比阿培南與內(nèi)標(biāo)一同提出，血漿雜質(zhì)蛋白不影響測(cè)定，且提取率高。

本試驗(yàn)隨機(jī)選取30名受試者進(jìn)行隨機(jī)分組測(cè)試，從各組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)看，各劑量組內(nèi)、各劑量組之間無顯著性個(gè)體差異，不同年齡、身高、體重、性別之間也無顯著性個(gè)體差異。

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