丙二酸次氮酰胺對刀豆蛋白刺激的膠原性關(guān)節(jié)炎模型大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞體外分化的影響

王婷玉，李俊，金芝貴，吳飛華，王小華，周倩（.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海000；.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 3003）

來氟米特是病情緩解藥，能夠延緩類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的疾病進(jìn)展，改善患者癥狀，提高其生活質(zhì)量，被廣泛用于RA的治療[1]。來氟米特是一種前體藥物，在體內(nèi)代謝成活性代謝物丙二酸次氮酰胺（A771726），以抑制二氫還原酶阻礙其合成嘧啶，從而抑制RA中淋巴細(xì)胞的增殖[2]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（CD4+CD25+Tregs）是近年發(fā)現(xiàn)的一類具有獨(dú)特免疫功能的細(xì)胞群，其以“主動(dòng)”方式維持自身穩(wěn)定，在調(diào)控外周自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。本文以刀豆蛋白（ConA）刺激的膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究A 771726對體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs分化的影響，考察A771726能否通過直接上調(diào)CD4+CD25+Tregs從而抑制脾淋巴細(xì)胞增殖；再進(jìn)一步研究A771726誘導(dǎo)CD4+CD25+Tregs分化的作用機(jī)制，包括CD4+CD25+Tregs特異性標(biāo)志物Foxp3的表達(dá)以及免疫性細(xì)胞因子的分泌。以期深入了解來氟米特抑制淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)而治療RA的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eclipse TE300型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Muliskan MK3酶標(biāo)儀（上海雷勃分析儀器有限公司）；Bio-RAD Power Pac Basic電泳儀（美國BIO-RAD公司）；FACScan流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Applied Biosystems基因擴(kuò)增儀9700系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；GSG2000核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

A771726原料藥（美國欣凱公司上海代表處，批號(hào)：080716，純度：96%）；Ⅱ型膠原（CⅡ，美國Sigma公司，批號(hào)：C7806）；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體和小鼠抗大鼠PE-CD25抗體（美國Caltag公司，批號(hào)：MR5101、MR6104）；RNA抽提試劑（Trizol）（美國Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026）；轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20080524）；聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠20只，♂，體重（110±20）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。

2 方法

2.1 建模

取大鼠20只，隨機(jī)均分為正常對照組和CIA模型組。將CⅡ溶入0.1mol·L－1的乙酸中制備成濃度為2 g·L－1的溶液，置于4℃攪拌過夜，與等體積弗氏不完全佐劑（IFA）混合，充分乳化，取0.5m L乳化后乳劑分5～6點(diǎn)分別注射于模型組大鼠背部脊柱兩側(cè)和尾根部的皮內(nèi)，1周后同法注射同等劑量乳劑作為繼發(fā)注射。正常對照組大鼠同法注射等量生理鹽水。

2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

造模后第35天，股動(dòng)脈放血處死大鼠，無菌分離脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/m L）。于96孔培養(yǎng)板上，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，分為正常組、模型組和A771726低、中、高劑量（0.1、1、10 μmol·L－1）[3]組，每組3個(gè)復(fù)孔，除正常組加入正常對照組大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液外，其余各組加入CIA模型組大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。各孔均加入50μL ConA（終濃度為3 μg·m L－1）刺激和相應(yīng)藥物培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，于終止培養(yǎng)前6 h，每孔加入5mg·m L－1的MTT 10 μL，繼續(xù)孵育6 h。每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，于酶標(biāo)儀上檢測570 nm波長處的光密度（OD）值，OD值越大，細(xì)胞增殖水平越高。

2.3 CD4+CD25+Tregs的檢測

為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高各個(gè)組間的平行性，本實(shí)驗(yàn)用藥組僅選用劑量最大、藥效最強(qiáng)的組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即分組為正常組、模型組和A771726高劑量組。于24孔培養(yǎng)板上，按“2.2”項(xiàng)下加入相應(yīng)細(xì)胞懸液500μL，后2組分別加入250μL含ConA（終濃度為3 μg·m L－1）或A771726（終濃度為10 μmol·L－1）的RPM I-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，1 500 r·m in－1離心5m in，吸棄上清，每個(gè)樣品中加入5μL小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體和2 μL小鼠抗大鼠PE-CD25抗體，4℃避光孵育30m in，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例。

2.4 Foxp3和TGF-βm RNA表達(dá)的檢測

分組和給藥同“2.2”項(xiàng)下操作，藥物作用于脾淋巴細(xì)胞懸液48 h后，1 500 r·m in－1離心5m in，吸棄上清，每個(gè)樣品中加入1m L Trizol提取總RNA，鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。Foxp3（320 bp）上游：5′-TAATATGCGGCCCCCTTTCACCTA-3′，下游：5′-GCCCCCGTCCATGTTTTCTTG-3′；TGF-β（407 bp）上游：5′-ATACAGGGCTTTCGCTTCAGTGCT-3′，下游：5′-CCCGGGTTGTGTTGGTTGTAGAG-3′；肌動(dòng)蛋白（β-actin）（543 bp）上游：5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游：5′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′。PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，檢測OD值，以β-actin的OD值為對照，計(jì)算目的基因mRNA的表達(dá)。

2.5 TGF-β濃度的檢測

分組和給藥同“2.2”項(xiàng)下操作，藥物作用于脾淋巴細(xì)胞懸液 48 h 后，2 000 r·m in－1離心 10min，收集上清。用 TGF-β ELISA試劑盒檢測上清中TGF-β的濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 脾淋巴細(xì)胞增殖比較

與正常組比較，模型組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，正常對照組，A771726低、中、高劑量組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平詳見圖1。

圖1 各組脾淋巴細(xì)胞增殖情況（n＝3）與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 1 Proliferation of sp lenic lym phocyte in each group（n＝3）vs.normalgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例

與正常組比較，模型組大鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，A771726組大鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例明顯升高（P＜0.05）。各組脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例比較見圖2。

3.3 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)情況

正常組、模型組和A771726低、中、高劑量組大鼠脾淋巴細(xì)胞中 Foxp3 mRNA 表達(dá)分別為：1.33±0.08、0.61±0.07、0.78±0.04、0.95±0.03、1.06±0.06。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組Foxp3mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，A771726低、中、高劑量組Foxp3mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。各組脾淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)的電泳圖詳見圖3。

圖2 各組脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例比較（n＝5）與正常組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05Fig 2 Comparison of the proportion of CD4+CD25+Tregs in CD4+T in sp lenic lymphocyteof each grou（pn＝5）vs.normalgroup：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

圖5 各組脾淋巴細(xì)胞中TGF-β濃度比較（n＝5）與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01Fig 5 Comparison of the content of TGF-βin Con A-induced sp lenocytes from CIA rat（sn＝5）vs.normalgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.01

圖3 各組脾淋巴細(xì)胞中Foxp3m RNA表達(dá)Fig 3 The expression of Foxp3m RNA in sp lenic lym phocyte of each group

3.4 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞中TGF-βm RNA表達(dá)情況

正常組、模型組和A771726低、中、高劑量組大鼠脾淋巴細(xì)胞中TGF-β mRNA表達(dá)分別為0.32±0.03、0.06±0.01、0.08±0.02、0.12±0.01、0.18±0.04。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組TGF-βmRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。A771726低、中、高劑量組TGF-βmRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。各組脾淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)的電泳圖詳見圖4。象，在體外培養(yǎng)體系中，研究了來氟米特活性代謝產(chǎn)物A771726對ConA活化的CIA模型大鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs的影響。結(jié)果表明，在ConA誘導(dǎo)的CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞體系中，A771726能提高CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，說明A771726對CD4+CD25+Tregs的分化具有促進(jìn)作用。Foxp3特異性地高表達(dá)于CD4+CD25+Tregs，直接參與CD4+CD25+Tregs的發(fā)育，在一定程度上可反映CD4+CD25+Tregs的水平和功能活性[6]。A771726能劑量依賴性增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的CIA模型大鼠脾淋巴細(xì)胞中Foxp3mRNA的表達(dá)，表明A771726激活了CD4+CD25+Tregs的抑制功能。TGF-β是一種炎性反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控因子，參與CD4+CD25+Tregs的發(fā)育和功能維持[7]。A771726能促進(jìn)ConA刺激的CIA模型大鼠脾淋巴細(xì)胞TGF-β的分泌及TGF-βmRNA表達(dá)的增強(qiáng)。

綜上所述，A771726可抑制CIA模型大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CD4+CD25+Tregs的分化，其機(jī)制可能與上調(diào)TGF-β的表達(dá)和促進(jìn)其分泌有關(guān)。

圖4 各組脾淋巴細(xì)胞中TGF-βmRNA表達(dá)Fig 4 The expression of TGF-βmRNA in sp lenic lym phocyteof each group

3.5 各組大鼠脾淋巴細(xì)胞中TGF-β濃度比較

與正常組比較，模型組大鼠脾淋巴細(xì)胞中TGF-β濃度明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，A771726中、高劑量組大鼠脾淋巴細(xì)胞中TGF-β濃度明顯升高（P＜0.01）。各組脾淋巴細(xì)胞中TGF-β濃度比較見圖5。

4 討論

CD4+CD25+Tregs是近年發(fā)現(xiàn)的一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在誘導(dǎo)和維持自身免疫耐受和阻止自身免疫性疾病的發(fā)生中起著重要作用[4]。CIA模型的癥狀和病理特征與人類RA相似，被廣泛用于研究RA的發(fā)病機(jī)制及篩選治療RA的藥物[5]。本文選用大鼠CIA模型模擬人類RA，以CD4+CD25+Tregs為研究對

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