酶法降解黑木耳多糖工藝研究

歐陽樂，王振宇，2＊

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090）

近年來，有越來越多的動植物及食藥用真菌來源的活性寡糖及其衍生物被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品、飼料添加劑、農(nóng)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，并不斷發(fā)現(xiàn)一些寡糖成分的新功能［1－4］。目前我國“富貴病”人數(shù)量明顯增多，心血管疾病在我國的發(fā)病率和死亡率明顯提高。經(jīng)研究表明，黑木耳多糖、寡糖作為重要的生物活性物質(zhì)，具有多種生物功能。而黑木耳多糖經(jīng)過降解后，形成數(shù)目巨大的木耳寡糖。而且黑木耳寡糖分子鏈短、水溶性極強，活性優(yōu)于多糖。β－葡萄糖苷酶已經(jīng)應(yīng)用于多糖的降解中，本項研究為將來開發(fā)功能性食品以及藥物提供了理論基礎(chǔ)［9］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑木耳、3，5－二硝基水楊酸（北京鎢信精細(xì)制劑廠）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、β－葡萄糖苷酶（上?？笊锛夹g(shù)有限公司）。

DNS試劑的配制［15］：稱取3.25g 3，5－二硝基水楊酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加2mol／L氫氧化鈉溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，搖勻，定容至500mL，儲存于棕色瓶放置在冰箱中待用。

β－葡萄糖苷酶：精確稱取β－葡萄糖苷酶0.0050g溶于少量pH值為5的磷酸－檸檬酸緩沖溶液中，定容于25mL容量瓶中。4℃冷藏。

1.2 實驗儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；粉碎機；電子分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機；精密pH計；紫外分光光度計；真空冷凍干燥機。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［13－14］

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 mL

準(zhǔn)確稱取干燥后的葡萄糖0.5000g，用蒸餾水溶解并定容至500mL容量瓶中。按表1進(jìn)行配置，充分混勻后于沸水浴5min。冷卻后加入蒸餾水2mL，混勻。以管1為空白對照，540nm波長下測吸光度。繪制吸光度－葡萄糖濃度曲線。

1.3.2 酶對黑木耳多糖的降解

1.3.2.1 β－葡萄糖苷酶用量對降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個具塞試管每管加入2.4mL多糖溶液，依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mLβ－葡萄糖苷酶溶液，剩余用緩沖溶液補上，在保證多糖濃度為0.3%，pH值為5.0，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)1h后立即加入1.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10min后，冷卻，加入5mL緩沖溶液。以第一組未加酶的管為空白樣在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.2 溫度對β－葡萄糖苷酶降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個具塞試管每管加入2.6mL多糖溶液以及0.4mL酶溶液，分別置于40、45、50、55、60、65、70℃的熱水中，確保多糖濃度為0.3%，pH值為5.0，反應(yīng)時間為1h。反應(yīng)結(jié)束后立即加入1.5mL DNS試劑，沸水浴10min后冷卻，每管加入2mL緩沖溶液?？瞻讟訛橹患尤刖彌_溶液的多糖溶液，然后在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.3 pH值對β－葡萄糖苷酶降解多糖釋放還原糖量的影響。取7個具塞試管，每管加入pH值從4到7不同的多糖溶液2.6mL以及0.4mL酶溶液，確保多糖濃度為0.3%，溫度為55℃，酶用量為0.4mL。反應(yīng)1h后立即加入1.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，然后沸水浴加熱10min，冷卻后加入2mL緩沖溶液。空白樣為只加入相應(yīng)pH值的0.3%多糖緩沖溶液，每個pH值設(shè)置一個，在540nm條件下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.2.4 時間對β－葡萄糖苷酶降解多糖還原糖釋放量的影響。配制濃度為0.3% 、pH值為5.5、加酶量為0.4mL的多糖溶液3mL，在反應(yīng)溫度為55℃時。反應(yīng)后在10、20、30、60、90、120min時取樣立即加入DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10min后，冷卻后加入2mL pH值為5.5的緩沖溶液?？瞻讟訛榧尤朊负罅⒓醇尤?.5mL DNS試劑，沸水浴處理10min的樣品。然后在540nm下測定其吸光度值，平行3次。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化降解條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以降解溫度、pH值、酶用量3個因素為自變量，還原糖的釋放量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗，使用MINITABL16軟件，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面法對β－葡萄糖苷酶對黑木耳多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

從圖1中可得葡萄糖的濃度與吸光度值之間的關(guān)系為：溶液中還原糖質(zhì)量（x）＝（吸光度（y）－0.002）／1.633，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999符合要求。表明葡萄糖在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律，該方程可用于還原糖的定量測定。

2.2 酶用量對β－葡萄糖苷降解效果的影響

圖2 酶用量對β－葡萄糖苷降解效果的影響

從圖2可以看出當(dāng)酶用量為0.4mL時，隨著酶用量的增加而增加，到達(dá)0.4mL時還原糖的釋放量達(dá)到了最大。此后隨著酶用量的增加還原糖的釋放量不再增多，從以上分析得出當(dāng)0.3%的多糖與0.2g／mL的β－葡萄糖苷酶的體積比為15∶2時酶降解達(dá)到飽和值。

2.3 溫度對β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖3 溫度酶降解效果的影響圖

由圖3可知，當(dāng)多糖濃度為0.3%，pH值為5.0時，β－葡萄糖苷酶的降解黑木耳多糖的最適降解溫度為55℃。在40～55℃之間隨著溫度的增高還原糖的釋放量酶活性不斷加大不斷增大，在55℃時達(dá)到了最大值，在55～70℃之間隨著溫度的不斷升高，酶不斷失活，還原糖的釋放量也不斷減少。

2.4 pH值對β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖4 pH值酶降解效果的影響圖

由圖4可知，當(dāng)多糖濃度為0.3%，反應(yīng)溫度為55℃，酶用量為0.4mL時。當(dāng)降解體系的pH值為5.5時β－葡萄糖苷酶對黑木耳多糖的降解達(dá)到了最大。在pH值在4～5.5之間時還原糖的釋放量隨pH值的增大而增大，在pH值5.5時達(dá)到最大值，在5.5～6.5時隨pH值的增大還原糖的釋放量降低。

2.5 反應(yīng)時間對β－葡萄糖苷酶降解效果的影響

圖5 反應(yīng)時間對酶降解效果的影響圖

由圖5可知，β－葡萄糖苷酶對黑木耳多糖的降解時間非常的短，從反應(yīng)開始到20min還原糖的釋放量隨時間的增加基本上呈直線增大。20min此后隨著時間的增加降解趨于平緩還原糖的釋放量也不再增加，因此選擇20min比較的經(jīng)濟(jì)。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化降解條件結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析

根據(jù)表1安排試驗，對試驗結(jié)果回歸擬合所得回歸模型如下：

由表3、4可知，決定系數(shù)R2＝98.96%，響應(yīng)面回歸模型高度顯著（P＝0.000），模型失擬項（P＝0.063），不顯著，說明該二次模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。

圖6 Y＝f（X2，X3）的響應(yīng)面與等高線

圖7 Y＝f（X1，X3）的響應(yīng)面與等高線

圖8 Y＝f（X1，X2）的響應(yīng)面與等高線

由圖6、7、8可知，酶的用量對β－葡萄糖苷酶降解黑木耳多糖的影響最大。溫度和pH值影響較小。依據(jù)回歸模型的數(shù)學(xué)分析并綜合響應(yīng)圖確定降解的最佳工藝參數(shù)為：降解溫度55.9℃，pH值為5.58，酶用量為0.475mL?；貧w模型預(yù)測的得率理論值為0.1948。取溫度55.9℃，pH 值為5.58，酶用量為0.475mL，試驗重復(fù)3次。3次平行試驗的OD值分別為0.195，0.192和0.198，平均為0.195，與理論預(yù)測值相比相對誤差為0.03%，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測β－葡萄糖苷酶對于黑木耳多糖的降解效果。

3 結(jié)論

本試驗研究酶法對黑木耳多糖進(jìn)行降解，運用了DNS法測定還原糖的釋放量作為研就究指標(biāo)，并用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化。得出了最佳的降解工藝。結(jié)論如下：最佳的降解工藝為多糖濃度為0.3%，溫度55℃、pH值5.5、反應(yīng)時間20min，每3mL多糖加入0.02%葡萄糖苷酶0.4mL時。響應(yīng)面優(yōu)化后，得出最佳工藝條件為：降解溫度55.9℃、pH值5.58、酶用量0.475mL。通過本文研究分析得出，酶法降解反應(yīng)后降解產(chǎn)物具有分子量分布窄、均一性好等優(yōu)點。該研究結(jié)果為將來制備黑木耳多糖寡糖、小分子黑木耳多糖在醫(yī)學(xué)、功能性食品開發(fā)等方面的應(yīng)用打下了堅實的理論基礎(chǔ)。

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