半制備液相法紅松樹皮多酚物質(zhì)分離技術(shù)的研究

黃雨洋，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；3.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150080）

紅松（Pinus koraiensis）亦稱果松、海松。常綠喬木，高達(dá)40m，葉五針一束，長6～12cm。球果卵狀圓錐形，種子大無翅。紅松種子長1.2～1.6cm，子葉13至16枚。紅松是主要分布于我國東北小興安嶺地區(qū)，是重要的農(nóng)林資源［1－2］。

常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林。耐旱性強，喜微酸性或中性土，針葉及球果中含有抗氧化活性成分，種子可食，入藥后具有祛風(fēng)除濕、滋養(yǎng)補虛的功效。

近年來，天然抗氧化劑的研究備受關(guān)注，其中多酚類是主要的抗氧化活性成分之一，松多酚即是此多酚類的成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤及抗菌等多種生物活性［3－4］。研究表明，紅松樹皮中含有大量的多酚物質(zhì)，為紅松樹皮的綜合利用、變廢為寶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅松樹皮 采于小興安嶺；甲醇美國TEDIA天地試劑公司，HPLC；三氟乙酸TFA北京迪馬科技有限公司，HPLC；去離子水水 杭州娃哈哈有限公司，分析純。

1.2 實驗儀器

制備型高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；超聲儀；天津泰斯特儀器公司；AB54型電子天平；梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；0.45μm微孔濾膜；北京化工二廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

紅松樹皮→乙醇提取［5］→大孔吸附樹脂AB－8（梯度洗脫→選取40%的洗脫→二級純化（制備型高效液相色譜儀）→各種因素進(jìn)行對比→結(jié)果

1.3.2 紅松多酚的一級純化

首先對大孔吸附樹脂AB－8進(jìn)行預(yù)處理：乙醇中浸泡AB－8大孔樹脂24h，待其充分溶脹后用蒸餾水反復(fù)洗滌，除去樹脂表面的殘留乙醇至無白色渾濁物出現(xiàn)。然后用8%鹽酸浸泡10h，用蒸餾水反復(fù)沖洗，用試紙測其pH7.0停止，再用5%氫氧化鈉溶液浸泡10h，在用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性、裝柱。用大孔吸附樹脂AB－8進(jìn)行梯度洗脫（20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇）對紅松多酚進(jìn)行一級純化，由于實驗時間的原因，本實驗采用40%乙醇洗脫液用半制備型液相進(jìn)行了二次純化。

1.3.3 半制備液相色譜法二級純化紅松多酚

1.3.3.1 紅松多酚樣品的配制。取0.1g經(jīng) AB－8型大孔樹脂40%乙醇洗脫液的一級純化凍干粉末溶解于10mL的甲醇溶液中，用0.45μm微孔濾膜過濾備用。

1.3.3.2 半制備液相的色譜條件。色譜柱為北京創(chuàng)新 Daisogel C18－10u100A，P3000 高 壓 輸 液 泵，UV3000可變波長檢測器，柱溫25℃下，流量分別為6、8、10mL／min，在紫外線波長分別為280、290、300、308、320、330、340nm下進(jìn)行，上樣量分別為0.25、0.5、0.75、1.0mL，并且在不同的濃度洗脫當(dāng)中進(jìn)行分離。

1.3.3.3 試驗操作步驟。流動相采用A和B兩種，溶劑A：甲醇并混入0.02%三氟乙酸（TFA），溶劑B：去離子水中混入0.02%TFA。溶劑梯度體積比例跟實驗要求設(shè)定。首先，設(shè)定波長、流速，用100%的甲醇對柱子進(jìn)行清洗。此后采用相同的紫外線波長和流速走基線，流動相采用不同的非線性濃度梯度的混合溶劑洗滌，直至基線平穩(wěn)方可進(jìn)樣。在出現(xiàn)比較的色譜峰是收集樣品，之后清洗色譜柱子。

1.3.3.4 觀測結(jié)果。根據(jù)半制備液相色譜峰型的高低，寬窄，面積，出峰時間可相對比較大致得出析出物質(zhì)的含量多少，面積較大者則意味著析出物質(zhì)的含量相對較多，從而可根據(jù)不同的因素條件對應(yīng)的不同峰型面積得出析出該種物質(zhì)含量最多的最佳各因素條件。

1.3.3.5 最佳工藝條件的研究

（1）流速對出峰面積的影響。在紫外線波長為308nm時，選取進(jìn)樣量為2針（即為0.5mL），采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環(huán)境下，分別選取流速為6、8、10mL／min進(jìn)行試驗。選取一流速后1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（2）進(jìn)樣量對出峰面積的影響。在紫外線波長為308nm，流速為8mL／min時，采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環(huán)境下，分別選取進(jìn)樣量為1針（0.25mL），2針（0.50mL），3針（0.75mL），4針（1.00mL）進(jìn)行試驗。選取一進(jìn)樣量后1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（3）紫外線波長對出峰面積的影響。在流速為8mL／min，進(jìn)樣量為1針（0.25mL）時，采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環(huán)境下，分別選取紫外線波長為280、290、300、308、310、320、330、340nm進(jìn)行試驗。選取一紫外線波長后按1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（4）濃度洗脫對出峰面積的影響。在流速為8mL／min，進(jìn)樣量為1針（0.25mL），在紫外線波長為308nm時，在相同的外界環(huán)境下，分別選取濃度洗脫：①0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。②0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。③0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。④0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。⑤0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B進(jìn)行試驗。選取一紫外線波長后按2.3.2.4的操作流程獲取峰型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 流速對出峰面積的影響

以下試驗均進(jìn)樣兩針（0.5mL），紫外線波長為308nm，濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）流速為6mL／min

圖1 色譜圖

（2）流速為8mL／min

圖2 色譜圖

（3）流速為10mL／min

圖3 色譜圖

由圖1～3可知在流速為6mL／min時，在77min時出現(xiàn)較大幅度的亂峰可能會導(dǎo)致析出的樣品不夠純正含有雜質(zhì)或含有多種未知物質(zhì)，此圖不能準(zhǔn)確反映紅松樹皮多酚物質(zhì)分離的效果，故不能使用。在圖2與圖3中我們可以觀察到二者峰型較為相似，流速為10mL／min的波型較好但考慮到流速的增加導(dǎo)致試劑的大量使用，使實驗成本增加，故由上述原因選定流速8mL／min為最佳流速。

2.2 進(jìn)樣量對出峰面積的影響

以下試驗均為紫外線波長為308nm，流速為8mL／min，濃度梯度為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）選取進(jìn)樣量為一針0.25mL

圖4 色譜圖

（2）選取進(jìn)樣量為2針0.50mL

圖5 色譜圖

（3）選取進(jìn)樣量為3針0.75mL

圖6 色譜圖

（4）選取進(jìn)樣量為4針1.00mL

圖7 色譜圖

由上述圖4～7發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣量為一針，兩針時的圖形較好析出的物質(zhì)較純，而進(jìn)樣量增加后峰型不如前者，進(jìn)樣一針和進(jìn)樣兩針相比較一針的較好，且用的樣品較少可以起到節(jié)約樣品用量的作用，故選取進(jìn)樣量一針（0.25mL）為最佳進(jìn)樣量。

2.3 紫外線波長對出峰面積的影響

以下試驗均為流速為8mL／min，進(jìn)樣量為1針（0.25mL），濃度梯度為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）紫外線波長為280nm

圖8 色譜圖

（2）紫外線波長為290nm

圖9 色譜圖

（3）紫外線波長為300nm

圖10 色譜圖

（4）紫外線波長為308nm

圖11 色譜圖

（5）紫外線波長為310nm

圖12 色譜圖

（6）紫外線波長為320nm

圖13 色譜圖

（7）紫外線波長為330nm

圖14 色譜圖

（8）紫外線波長為340nm

圖15 色譜圖

由以上圖8～15可分析到紫外線波長才280nm時，最高峰出叉，證明該峰中不僅只含有一種物質(zhì)，可能還含有兩種以及兩種以上物質(zhì)，故此波長不予采用。紫外線波長在290nm、300nm、310nm、320nm時均有雜質(zhì)峰的出現(xiàn)并且出峰時間長試劑用量大，故不予使用。紫外線波長為330nm、340nm時峰型較寬含有過多較大的雜質(zhì)峰，析出樣品量不夠理想故不予使用，綜上所述，選取波長為308nm為最佳波長。

2.4 濃度洗脫對出峰面積的影響

以下試驗均在流速為8mL／min，進(jìn)樣量為1針（0.25mL），在紫外線波長為308nm時完成。

（1）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖16 色譜圖

（2）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。

圖17 色譜圖

（3）洗脫濃度為0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖18 色譜圖

（4）洗脫濃度為0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。

圖19 色譜圖

（5）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖20 色譜圖

由上述圖16～20可分析可知圖18、圖20出峰時間較長，試劑使用較多故不予使用。圖17、圖19有過多雜質(zhì)峰，且雜質(zhì)峰的波動較大對析出物質(zhì)的純度影響較深，故不予使用。因此可得出濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B為最佳濃度洗脫。0～10min，0A／100B。

3 結(jié)論

通過單因素試驗得出利用半制備液相法對紅松樹皮多酚物質(zhì)分離的最佳工藝條件為：流速為8mL／min，進(jìn)樣量為一針（0.25mL），紫外線波長為308nm，濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

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