微弧氧化鎂合金對(duì)兔骨骼肌細(xì)胞黏附和增殖的影響

張 濤，尹慶水，夏 虹，張 余，李 梅，楊小明，藍(lán)國(guó)波

鎂合金是一種新型可降解金屬材料，具有良好的降解性和生物相容性[1]，但其降解速度較快，臨床應(yīng)用受到一定限制。微弧氧化（microarc oxidation，MAO）處理可使鎂合金表面形成粗糙面，有利于成骨細(xì)胞吸附，耐蝕性能也明顯改善[2-3]。本研究試圖通過(guò)觀察MAO鎂合金、鎂合金、鈦合金對(duì)骨骼肌細(xì)胞黏附及增殖影響的比較研究，以評(píng)價(jià)MAO鎂合金材料的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本大耳兔3只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑和試件材料

DMEM培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；碘化丙啶染色劑（江蘇碧云天公司）；CCK-8（日本同仁公司）；慶大霉素（廣東邦民制藥廠有限公司）。醫(yī)用鈦合金、鎂合金AZ31B均由中科院金屬研究所提供，規(guī)格均為直徑10 mm、厚3 mm圓片狀。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

根據(jù)材料試件的不同分為3組：（1）對(duì)照組：采用醫(yī)用鈦合金，磨平拋光后，丙酮和無(wú)水乙醇超聲清洗，消毒后待用；（2）鎂合金組：采用鎂合金AZ31B，磨平拋光后，丙酮和無(wú)水乙醇超聲清洗，消毒后待用；（3）MAO組：采用鎂合金AZ31B，磨平拋光后，丙酮和無(wú)水乙醇超聲清洗，進(jìn)而采用MAO技術(shù)（表面打磨平整、脫脂處理、中和、水洗、SIMOXIDE微弧氧化、水洗、干燥、封閉處理[2]），處理后得到MAO鎂合金，消毒待用。

1.4 兔骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取兔臀部肌肉1 cm3，置于冷D-Hank液中，加入104U/L慶大霉素反復(fù)沖洗，去除結(jié)締組織，保留肌肉組織，剪成1 mm3左右的小塊，按照組織塊法[4]置于培養(yǎng)瓶中貼附，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.5 浸提液的制備

根據(jù)ISO 10993醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]，按照材料表面積/浸提介質(zhì)為1.25 cm2/mL的比例，向裝有鎂合金及MAO鎂合金材料的容器中加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育、浸泡24 h，獲得鎂合金提取液和MAO鎂合金提取液，4℃冷藏，24 h內(nèi)使用。

1.6 細(xì)胞黏附率的測(cè)定

取3塊24孔培養(yǎng)板，分別在每塊板中放置18枚材料試件，每組6枚；將兔骨骼肌細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、6、24 h；各取出1塊培養(yǎng)板，PBS漂洗3次，吸凈液體，0.25%胰蛋白酶1.0 mL消化1 min；加入含血清的培養(yǎng)基1.0 mL終止消化，1000 r/min離心5 min，吹打制成細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算黏附率，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞黏附率（%）=已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的測(cè)定

0.25 %胰蛋白酶消化兔骨骼肌細(xì)胞，取1×104/L細(xì)胞懸液200 μL接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。鎂合金組、MAO組分別將培養(yǎng)液更換為鎂合金浸提液和MAO鎂合金浸提液；對(duì)照組則加入高糖DMEM培養(yǎng)基，2 d更換1次。分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，PBS清洗后加入20 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處吸光度（optical density，OD），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，計(jì)算相對(duì)增殖率。細(xì)胞相對(duì)增殖率（%）=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。根據(jù)細(xì)胞增殖率進(jìn)行毒性評(píng)級(jí)[6]：0級(jí)：100%；1級(jí)：80%～99%；2級(jí)：50%～79%；3級(jí)：30%～49%；4級(jí)0～29%。

1.8 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

將1×106/L的細(xì)胞懸液2 mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h；鎂合金組、MAO組分別將培養(yǎng)液更換為鎂合金浸提液和MAO鎂合金浸提液；對(duì)照組加入高糖DMEM培養(yǎng)基；分別培養(yǎng)3 d后，加入0.25%胰蛋白酶，將細(xì)胞消化成為單細(xì)胞懸液；加入1 mL冰浴預(yù)冷的乙醇，4℃過(guò)夜，1000 g離心4 min沉淀細(xì)胞，吸除上清；加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞；再次離心后，加入碘化丙啶染色劑，37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀488 nm處進(jìn)行測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞黏附率的測(cè)定結(jié)果

培養(yǎng)2、6、24 h時(shí)，3組細(xì)胞黏附率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中MAO組與對(duì)照組、鎂合金組各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞黏附率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組細(xì)胞黏附率呈時(shí)間依賴性增加（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 3組細(xì)胞相對(duì)增殖率的比較結(jié)果

培養(yǎng)后1、3、5、7 d，3組細(xì)胞相對(duì)增殖率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中MAO組細(xì)胞相對(duì)增殖率高于鎂合金組（P＜0.05），但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在不同時(shí)相點(diǎn)，鎂合金組細(xì)胞相對(duì)增殖率呈時(shí)間依賴性下降（F=12.385，P=0.000）；而MAO組細(xì)胞各時(shí)相點(diǎn)相對(duì)增殖率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.197，P=0.332）。見(jiàn)表2。

鎂合金組毒性評(píng)級(jí)為2級(jí)；MAO組毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，具有良好的生物相容性。

2.3 3組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組和MAO組細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡，無(wú)明顯細(xì)胞毒性；而鎂合金組可見(jiàn)部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，提示鎂合金存在部分細(xì)胞毒性。見(jiàn)圖1。

表1 不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞黏附率的比較結(jié)果（±s，%）

表1 不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞黏附率的比較結(jié)果（±s，%）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與鎂合金組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組鎂合金組MAO組F值P值2 h 26.46±2.3323.88±2.9031.79±1.71*#18.4920.0006 h 33.92±2.2628.75±2.46*39.75±1.56*#41.4050.00024 h 47.21±2.1136.79±1.66*55.25±1.69*#162.7790.000 F值86.399292.739140.238 P值0.0000.0000.000- -- -

表2 不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞相對(duì)增殖率的比較結(jié)果（±s，%）

表2 不同時(shí)相點(diǎn)3組細(xì)胞相對(duì)增殖率的比較結(jié)果（±s，%）

注：*與對(duì)照組比較，P ＜0.05；#與鎂合金組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組鎂合金組MAO組F值P值1 d 10083.1±1.2*98.0±2.2#242.6510.0003 d 10081.6±1.0*97.3±1.1#810.6705 d 10079.1±1.0*96.1±2.1#410.51607 d 10078.9±2.8*97.0±2.5#166.870

3 討論

3.1 鎂合金的優(yōu)缺點(diǎn)

鈦合金是目前臨床上最常用的骨科植入材料，具有良好的生物相容性，但存在被人體吸收的可能性，術(shù)后患者需接受二次手術(shù)取出內(nèi)固定。因此，尋找一種可降解吸收的植入材料成為當(dāng)前骨科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

鎂合金是近年來(lái)新興的一種可降解金屬材料，作為骨科植入材料具有其他金屬難以比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1）密度為1.74 g/cm3左右，與人的密質(zhì)骨密度（1.75 g/cm3）基本相當(dāng)；（2）比強(qiáng)度和比剛度高，鎂合金的楊氏模量約為45 GPa，接近人骨20 GPa左右的彈性模量[7]，可避免應(yīng)力遮擋效應(yīng)；（3）鎂是人體內(nèi)僅次于鈣、鈉和鉀的常量元素（成人每人每日需要量超過(guò)350 mg），與神經(jīng)、肌肉及心臟功能關(guān)系密切[8]。但鎂合金的腐蝕破壞速度較快，難以滿足臨床要求[9]，這成為限制其臨床應(yīng)用的主要瓶頸。為進(jìn)一步減緩鎂合金降解速度，學(xué)者們探索了一系列鎂合金表面的處理方法，如電化學(xué)電鍍、化學(xué)轉(zhuǎn)化、陽(yáng)極氧化、氣相沉積、激光表面改性和有機(jī)涂層等[10-11]，其中MAO作為一種新型的金屬表面處理技術(shù)，近年來(lái)得到材料學(xué)及醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

3.2 MAO鎂合金的優(yōu)點(diǎn)

MAO是一種在有色金屬表面原位生成氧化膜的新技術(shù)。該技術(shù)將鋁、鈦、鎂等金屬置于電解質(zhì)溶液中，在熱化學(xué)、等離子化學(xué)和電化學(xué)的共同作用下，使材料表面產(chǎn)生火花放電生成陶瓷層。MAO技術(shù)可顯著提高上述材料的耐蝕性、耐磨性和硬度，目前已被廣泛應(yīng)用于航空、航天、機(jī)械、電子、紡織、裝飾等領(lǐng)域[2]。同時(shí)，MAO也是一種很有前景的醫(yī)用金屬植入體表面生物改性技術(shù)，已成功應(yīng)用于鈦種植體表面[12]。

與其他表面處理方法相比較，MAO技術(shù)的綜合性能更加適合于生物醫(yī)用環(huán)境中鎂合金的表面處理。它具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）耐腐蝕、耐磨性能更好；（2）與基體結(jié)合緊密、不易脫落；（3）可在金屬表面形成粗糙面，有利于成骨細(xì)胞吸附；（4）與通常的陽(yáng)極氧化處理相比，對(duì)材料的疲勞強(qiáng)度影響較小[3]。黃震等[13]的研究結(jié)果顯示，經(jīng)MAO技術(shù)處理后的AZ9lD鎂合金具有良好的成骨細(xì)胞相容性，有利于MG63細(xì)胞的早期黏附。柳麟翔等[14]以鈦合金作為對(duì)照，將MAO鎂合金植入兔股骨，術(shù)后4周和12周取材觀察材料與骨組織的結(jié)合情況，結(jié)果表明，MAO AZ91D鎂合金具有較好的骨結(jié)合性能。亦有學(xué)者研究MAO鎂合金對(duì)人體組織的影響，以明確其是否能夠真正進(jìn)入臨床。吳婕等[15]觀察經(jīng)MAO處理的AZ91D鎂合金浸提液對(duì)口腔黏膜的刺激性，結(jié)果表明，MAO鎂合金未對(duì)組織造成明顯的不良刺激反應(yīng)。苗波和姜德志[16]將MAO鎂合金植入動(dòng)物下頜骨內(nèi)，動(dòng)物肝臟和腎臟的病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果均提示其未造成不良影響。這些結(jié)論均證實(shí)了MAO鎂合金良好的生物相容性。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡情況

3.3 MAO鎂合金對(duì)骨骼肌細(xì)胞黏附及增殖的影響

作為四肢骨關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力裝置，骨骼肌對(duì)于骨關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的意義重大。MAO鎂合金植入體內(nèi)后，除了接觸骨骼外，還要接觸骨骼肌，這種材料對(duì)骨骼肌組織的生物相容性如何，對(duì)于骨骼肌細(xì)胞黏附、增殖有無(wú)影響，目前尚沒(méi)有準(zhǔn)確的結(jié)論。有研究結(jié)果表明，影響?zhàn)じ降囊蛩匕ú牧媳砻娴男蚊?、粗糙度、表面元素成分及金相結(jié)構(gòu)等[17]，這些影響因素不是孤立存在的，而是共同作用以對(duì)材料表面的細(xì)胞黏附造成影響[18]。

本研究結(jié)果顯示，MAO組細(xì)胞黏附率高于對(duì)照組和鎂合金組，說(shuō)明MAO鎂合金的表面可能更適合于骨骼肌細(xì)胞的黏附。此外，MAO組細(xì)胞增殖率與對(duì)照組接近，高于鎂合金組；MAO組毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，低于鎂合金組的2級(jí)毒性；進(jìn)一步的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，MAO組未見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果均證實(shí)，MAO鎂合金降解速度減緩，毒性減弱，生物相容性更加優(yōu)良。

綜上所述，鎂合金AZ31B經(jīng)MAO技術(shù)處理后對(duì)于兔骨骼肌細(xì)胞具有良好的黏附作用，且不影響細(xì)胞增殖，這為其在骨科植入材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供了部分理論依據(jù)，但MAO鎂合金對(duì)人骨骼肌細(xì)胞的作用還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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