VEGF基因沉默對肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和遷移的影響

宋向芹，司秀文，張 芳，趙延婷

(濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濱州256603)

研究表明［1，2］肝癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、通過不同基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過程，癌細(xì)胞早期侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌患者死亡的重要因素之一［3］。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是目前已知在原發(fā)性肝癌血管生成中作用最強(qiáng)的血管生成誘導(dǎo)因子，可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、提高血管的通透性、促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展［4］。2011年1月～2012年1月，我們采用RNA干擾技術(shù)沉默VEGF基因，觀察其對人肝癌細(xì)胞株HepG2遷移和侵襲的影響，為肝癌的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將相關(guān)研究報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PCR引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 (Lipofectami 2000，Invitrogen公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根公司)，凝膠回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］。質(zhì)粒pGenesil-1和人肝癌細(xì)胞株HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 HepG2的培養(yǎng) HepG2培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長融合80% ～90%時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代，選用對數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 VEGF-siRNA重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和VEGF基因沉默 采用siRNA技術(shù)沉默HepG2細(xì)胞內(nèi)VEGF基因。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成針對VEGF的3種siRNA和1個(gè)陰性對照，對pGenesil-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，再進(jìn)行pGenesil-1質(zhì)粒酶切大片段產(chǎn)物的回收與純化，用 T4DNA連接酶將干擾片段與pGenesil-1載體連接起來，成功構(gòu)建3種siRNA表達(dá)載體和1個(gè)陰性對照，分別命名為pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3 和 pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。用0.25%的胰酶消化 HepG2，將細(xì)胞接種于6孔板中，5×105/孔，當(dāng)細(xì)胞的融合至70% ～80%時(shí)Lipofectamin 2000)介導(dǎo)將pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3分別轉(zhuǎn)染 HepG2。轉(zhuǎn)染前24 h更換為無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h更換為正常的DMEM培養(yǎng)液。用RT-PCR法［5］篩選出沉默效果最好(即VEGF表達(dá)量最少)的siRNA片斷即pGenesil-1-VEGF-shRNA-2(見圖1)。

圖1 HepG2中VEGF mRNA表達(dá)量

1.4 細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6］的方法，將pGenesil-1-VEGF-shRNA-2轉(zhuǎn)染HepG2(觀察組)，以轉(zhuǎn)染pGenesil-1空質(zhì)粒細(xì)胞(空載組)和未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞(空白組)作為對照。將三組細(xì)胞分別接種于24孔板中(5×105/孔)，待細(xì)胞生長至單層完全融合時(shí)，以100 μL微量移液槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”形劃痕，制造細(xì)胞創(chuàng)傷模型，每組平行3個(gè)樣本，記錄劃痕區(qū)相對距離。PBS沖洗2～3次后繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后在顯微鏡下監(jiān)測創(chuàng)傷愈合程度，并于200倍視野下拍照。用電子尺軟件分別測量每組在0、24 h劃痕兩側(cè)細(xì)胞間的距離，按公式計(jì)算遷移速度(遷移速度=遷移距離/遷移時(shí)間)。

1.5 Transwell小室體外侵襲試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行三組細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)。比較三組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組細(xì)胞遷移速度為(3.02 ±0.03)μm/h，明顯慢于空載組的(8.67±0.02)μm/h和空白組的(8.78 ±0.03)μm/h，P 均 ＜0.05。觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(14.0±1.3)個(gè)，顯著低于空載組的(35.0±2.3)個(gè)和空白組的(36.0 ±2.5)個(gè)，P 均 ＜0.05。

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤血管生成有密切的聯(lián)系［8］。肝癌組織中VEGF的表達(dá)顯著高于正常肝組織［9］，且隨著肝癌的進(jìn)展呈上升趨勢。已有研究表明VEGF是潛在的肝癌預(yù)后分子之一［10］。因此，抑制VEGF的表達(dá)是抗肝癌血管生成治療的有效途徑之一。

RNA干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的利用外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA以高度序列特異性方式抑制基因表達(dá)的過程，具有高靶向性、高穩(wěn)定性、高效率性、高特異性及高穿透性等特點(diǎn)。它是通過雙鏈RNA的介導(dǎo)特異地降解相應(yīng)序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平，使基因沉默［11］。

本研究采用siRNA技術(shù)沉默VEGF mRNA，成功構(gòu)建針對VEGF的3種siRNA表達(dá)載體和1個(gè)陰性對照，在相同條件下轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞，產(chǎn)生的干擾效果有差異，其中以pGenesil-1-VEGF-shRNA-2干擾效果最好，其抑制效果接近80%，可作為下一步分析研究的優(yōu)選干擾片斷。本研究中細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)顯示，觀察組即pGenesil-1-VEGF-shRNA-2重組質(zhì)粒細(xì)胞遷移速度較空載體組和空白組明顯減慢(P均＜0.05)，說明VEGF與肝癌細(xì)胞的遷移有關(guān)。細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)?zāi)荛g接反映HepG2的侵襲能力。Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染 pGenesil-1-VEGF-shRNA-2細(xì)胞即觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，與空載組和空白組相比，P均＜0.05。這表明VEGF下調(diào)可以顯著降低肝癌細(xì)胞株HepG2的體外侵襲能力。VEGF基因與肝癌細(xì)胞株HepG2的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，VEGF基因 siRNA表達(dá)載體可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲，因此VEGF在HepG2的生長轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，為臨床靶向干預(yù)VEGF信號(hào)通路，抑制肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，但是導(dǎo)致這些改變的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

總之，我們采用 RNA干擾技術(shù)成功合成的VEGF siRNA，證實(shí)能特異、有效地抑制體外肝癌HepG2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，并可望通過靶向阻斷VEGF表達(dá)途徑以阻斷VEGF促血管形成，從而阻止肝癌的生長與轉(zhuǎn)移，為肝癌治療開辟新途徑。

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