膀胱移行細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)與染色體畸變的相關(guān)性研究

張婷婷，李錦毅

(1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001;2中國武警總醫(yī)院)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，90%為膀胱移行細(xì)胞癌(TCCB)，具有多中心起源及易復(fù)發(fā)、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)。膀胱癌術(shù)后2年復(fù)發(fā)率達(dá)70% ～80%［1］。如何有效地預(yù)防和檢測膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)，是提高患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵和迫切需要解決的難題。有文獻(xiàn)報(bào)道，與膀胱癌復(fù)發(fā)的相關(guān)染色體主要有3、5、7、9、11、17 號染色體［2］。為了探討TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)與染色體畸變的關(guān)系，2011年1月～2012年1月，我們分析了3、7、17號染色體及9號染色體p16基因位點(diǎn)的畸變與TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集中國武警總醫(yī)院TCCB組織石蠟標(biāo)本35例，均經(jīng)病理證實(shí)。35例患者中，男20例、女15例，平均年齡63歲。均行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，其中術(shù)后未復(fù)發(fā)16例;復(fù)發(fā)19例，初次復(fù)發(fā)10例，復(fù)發(fā)2次或超過2次者9例。19例復(fù)發(fā)性TCCB中，根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)癌癥分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ta～T112例，T2～T47例;根據(jù)2004 年 WHO TCCB 分級標(biāo)準(zhǔn)，G1級9 例，G2～3級10例。另選10例TCCB癌旁正常組織為對照。

1.2 主要儀器與試劑 熒光顯微鏡、相應(yīng)的濾光片組及分析軟件(日本Olympus公司生產(chǎn))，膀胱癌細(xì)胞染色體及基因異常檢測試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，胃蛋白酶。

1.3 TCCB組織中3、7、17號染色體及9號染色體p16基因的檢測方法 采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測。所有標(biāo)本用10%甲醛固定8～24 h，石蠟包埋，3～4 μm厚切片。脫蠟2次，組織切片經(jīng)酶消化、脫水。自然干燥玻片。將10 μL(雜交緩沖液8 μL+探針2 μL)的探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，用橡皮膠封邊。放入濕盒雜交。暗處自然干燥玻片。將20 μL的4，6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。完成雜交。

結(jié)果判定:采用熒光顯微鏡觀察，電荷耦合設(shè)備相機(jī)攝取圖像，F(xiàn)ISH 2.0軟件處理。每組探針組合分析100個(gè)細(xì)胞，選擇雜交信號均勻、清晰的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞畸變的百分比。TCCB組織中正常染色體表現(xiàn)為紅、綠色信號(各為2個(gè))，如多于或少于2個(gè)信號，即為發(fā)生染色體畸變。

依據(jù)北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司推薦的方法，建立10例癌旁正常組織中3、7、17號染色體及9號染色體p16基因位點(diǎn)畸變閾值(閾值=ˉx+3×s)。見表1。如檢測值＞閾值，則判定為陽性;如檢測值＜閾值，判定為陰性;如檢測值=閾值，則增加樣本細(xì)胞的數(shù)量。如該樣本僅1個(gè)探針出現(xiàn)異常，提示該樣本FISH結(jié)果為陰性;如出現(xiàn)兩個(gè)以上異?；蛲划惓６啻纬霈F(xiàn)，則為FISH結(jié)果陽性。

表1 癌旁正常組織中各染色體畸變閾值(%)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料用四格表Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用兩分類變量的關(guān)聯(lián)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCCB組織中染色體畸變率 19例復(fù)發(fā)性TCCB組織中，3、7、17號染色體及9號染色體p16基因的畸變率分別為 42.11%、57.89%、84.21%和89.47%;16例未復(fù)發(fā)性TCCB中分別為31.25%、37.50%、43.75%和 50.00%，復(fù)發(fā)者的 17 號染色體和9號染色體p16基因的畸變率與未復(fù)發(fā)者比較，P均＜0.05。在復(fù)發(fā)性TCCB中，17號染色體畸變主要表現(xiàn)為多倍體，占57.89%，9號染色體p16基因主要表現(xiàn)為缺失，占68.42%。

2.2 染色體畸變與TCCB臨床病理指標(biāo)的關(guān)系17號染色體和9號染色體p16基因位點(diǎn)的畸變與TCCB復(fù)發(fā)有關(guān)(P＜0.05);復(fù)發(fā)性TCCB的 G1級與G2～3級組織中7號染色體畸變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各染色體畸變率與TCCB病理分期、復(fù)發(fā)次數(shù)無關(guān)(P均＞0.05)。見表2。

表2 染色體畸變與TCCB臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 染色體畸變與TCCB復(fù)發(fā)及組織分級的相關(guān)性 17號染色體和9號染色體p16基因位點(diǎn)畸變率與TCCB復(fù)發(fā)呈正相關(guān)(r分別為0.391和0.399，P均＜0.05);7號染色體畸變率與復(fù)發(fā)性TCCB組織分級呈正相關(guān)(r=0.565，P ＜0.05)。

3 討論

TCCB發(fā)生發(fā)展過程中存在基因的缺陷和染色體異常，且復(fù)發(fā)與染色體畸變有關(guān)［2］。研究結(jié)果表明［3］，F(xiàn)ISH 陽性低風(fēng)險(xiǎn)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比為 1.6，高風(fēng)險(xiǎn)患者的復(fù)發(fā)率更高，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比為1.9。膀胱癌復(fù)發(fā)與染色體畸變具有相關(guān)性，畸變率越高，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越大。

FISH主要用于檢測染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)的畸變，其基本原理是用已知標(biāo)記的單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。FISH探針具有穩(wěn)定、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，在染色體定性定量檢測中能通過堿基互補(bǔ)保證反應(yīng)的特異性。因此我們采用該技術(shù)，利用3、7、17號染色體著絲粒探針和9號染色體p16基因位點(diǎn)探針檢測TCCB組織中染色體異常的情況，并分析其畸變與TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，在TCCB復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)組織中17號染色體和9號染色體p16基因畸變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，且呈正相關(guān)關(guān)系，說明TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)與17號染色體和9號染色體p16基因的畸變密切相關(guān)。后兩者有可能成為TCCB早期診斷及術(shù)后檢測復(fù)發(fā)的重要分子標(biāo)志物。

研究表明，TCCB復(fù)發(fā)與染色體畸變的嚴(yán)重程度及腫瘤分級有關(guān)［4］。本研究結(jié)果顯示，在復(fù)發(fā)性TCCB的G1級與G2～3級組織中7號染色體畸變差異顯著(P＜0.05)，G2～3級組織中 7號染色體畸變率明顯高于G1級，說明染色體畸變可促進(jìn)TCCB發(fā)生發(fā)展。

p16基因定位于人類的第9號染色體短臂2區(qū)1帶(9p21)，其表達(dá)產(chǎn)物p16蛋白直接參于細(xì)胞分裂增殖的負(fù)性調(diào)控［5］，9p21位點(diǎn)的缺失在膀胱癌的早期時(shí)常發(fā)生［6］，9號染色體單倍體的發(fā)生是復(fù)發(fā)性膀胱癌的早期事件，9號染色體的缺失被認(rèn)為是膀胱癌發(fā)生的啟動(dòng)標(biāo)志［7，8］。p16基因的缺失被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素［8］。本研究中，9號染色體p16基因的畸變與TCCB復(fù)發(fā)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。在復(fù)發(fā)性TCCB組織中，9號染色體p16基因畸變率高達(dá)89.47%，明顯高于未復(fù)發(fā)性TCCB的50.00%，且主要表現(xiàn)為染色體缺失，提示TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)與9號染色體p16基因的畸變密切相關(guān)，尤其是p16基因的缺失，為判斷TCCB預(yù)后提供了重要的依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)［9，10］，17 號染色體多倍體的出現(xiàn)與膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，可以作為檢測膀胱癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)。本研究中，在復(fù)發(fā)性TCCB組織中17號染色體多倍體占57.89%，說明復(fù)發(fā)性TCCB中17號染色體異常主要表現(xiàn)為多倍體。與以上研究結(jié)果相符。在復(fù)發(fā)性TCCB組織中17號染色體畸變率(84.21%)明顯高于未復(fù)發(fā)性 TCCB(43.75%)，且其畸變與TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān)關(guān)系，說明17號染色體畸變對檢測TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)有重要的臨床價(jià)值。

綜上，TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)與其染色體畸變有關(guān)，特別9號染色體的p16基因及17號染色體畸變，可以作為預(yù)測TCCB術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)。

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