阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)不同環(huán)節(jié)對肝纖維化大鼠肝組織的影響

焦占江，周 杰，崔忠林，錢建平，曾德華

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515;2福州軍區(qū)總醫(yī)院)

肝纖維化是諸多肝病共同的病理改變。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在肝纖維化形成中起著重要的作用。RAAS除了存在于循環(huán)系統(tǒng)中外，還存在于許多組織器官中，如心、腎、肺、胰、肝等［1］。研究表明［2］，肝內(nèi) RAAS 參與肝纖維化的發(fā)展。2011年～2012年，我們通過研究阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)對肝纖維化大鼠肝組織的影響，從病理學(xué)角度探討拮抗RAAS不同環(huán)節(jié)抗肝纖維化的實驗依據(jù)?，F(xiàn)將相關(guān)研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ①藥品及主要試劑:氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品)，卡托普利片(湖南湘雅制藥有限公司產(chǎn)品)，螺內(nèi)酯片(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品);Masson三色染色試劑盒購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。②實驗動物:6周齡清潔級SD大鼠(福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)50只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～220 g，室溫18～25℃，濕度30% ～50%，精制飼料喂養(yǎng)。

1.2 動物分組、模型制備及用藥 將50只大鼠按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分為正常組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組和螺內(nèi)酯組，各10只。正常組皮下注射橄欖油，余大鼠予40%CCl4腹壁皮下注射，3 mL/kg，首劑加倍，1次/3 d，復(fù)制大鼠肝纖維化模型;次日，卡托普利組用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利60 mg/kg、氯沙坦組用血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦10 mg/kg、螺內(nèi)酯組用醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯100 mg/kg(均用10 mL生理鹽水稀釋后)灌胃，模型組和正常組用10 mL生理鹽水灌胃，均1次/d，于第8周處死所有動物，取右肝組織，液氮保存，備測。

1.3 觀察指標(biāo) ①觀察大鼠體質(zhì)量、精神、飲食、活動、死亡等一般情況。②肝組織病理學(xué)改變:肝組織用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行HE和Massion染色。行 Kondell評分［3］并對肝纖維化程度進(jìn)行分級，0級:無纖維化;1級:匯管區(qū)纖維化;2級:匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大;3級:橋接樣纖維化;4級:肝硬化。采用Image-pro計算機(jī)圖像分析軟件測定肝膠原面積，計算其占視野總面積的百分比，測6次，取均值為肝纖維化面積比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，計量資料比較采用方差分析，計數(shù)資料采用秩和檢驗。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物一般狀態(tài) 正常組大鼠精神良好，毛色光澤，運動活潑，反應(yīng)敏銳，進(jìn)食、飲水正常，體質(zhì)量增加;模型組大鼠精神萎靡，活動少，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食、飲水少，體質(zhì)量下降明顯;卡托普利組、螺內(nèi)酯組、氯沙坦組大鼠精神、活動、反應(yīng)、飲食、體質(zhì)量均較模型組好。

2.2 肝組織病理變化 HE染色:正常組見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)完整;模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，空泡形成，匯管區(qū)擴(kuò)大，匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤，假小葉形成;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組見肝細(xì)胞壞死及空泡變性減少，淋巴細(xì)胞浸潤減少。Masson染色:正常組膠原纖維在血管周圍少量表達(dá);模型組膠原纖維增生明顯，纖維間隔形成，可見弓形纖維，部分區(qū)域形成假小葉;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組膠原纖維減少，形成的纖維間隔和假小葉明顯減少。各組大鼠肝纖維化程度分級比較見表1，肝纖維化面積比、Kondell評分比較見表2。

表1 各組肝纖維化大鼠肝纖維化程度分級(例)

表2 各組肝纖維化面積比、Kondell評分比較(ˉx±s)

3 討論

肝纖維化是肝細(xì)胞肝癌的危險因素之一［4］。不同病因(如病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積等)引起的慢性肝損傷最終會導(dǎo)致以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)各成分合成增多，降解相對不足，過多沉積在肝內(nèi)，引起肝纖維化［4，5］。肝纖維化的特征不僅是肝組織中基質(zhì)蛋白濃度的增加，包括膠原、彈力蛋白、結(jié)構(gòu)糖蛋白、蛋白多糖及透明質(zhì)酸，而且是基質(zhì)成分的改變。其中，肝星狀細(xì)胞是肝纖維化過程中生成纖維的主要細(xì)胞。在正常肝組織中，肝星狀細(xì)胞主要用來儲存維生素A［5］。受傷后，肝星狀細(xì)胞激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，能產(chǎn)生一系列的促纖維化、促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子和化學(xué)因子，也能產(chǎn)生纖維組織的ECM成分，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。

RAAS是機(jī)體調(diào)節(jié)血管張力和鈉水代謝的內(nèi)分泌系統(tǒng)。器官和組織也能合成RAAS的全部或大部分成分，稱為局部RAAS，其主要與組織纖維化和(或)重構(gòu)過程有關(guān)，如心肌梗死后纖維化、心肌肥厚、腎纖維化和皮膚纖維化等。肝臟亦存在局部RAAS。研究表明［1］，隨著肝臟的受損，可觀察到RAAS的成分如血管緊張素原、腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ的上調(diào)或重新分布。局部組織RAAS在組織纖維的形成中具有重要的促進(jìn)作用，其效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ和醛固酮是重要的致炎因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和ECM的合成［6］。亦有研究表明，RAAS的主要活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ和醛固酮作用于肝星狀細(xì)胞，通過激活轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、血小板衍生因子(PDGF)等細(xì)胞因子或直接促進(jìn)肝星狀細(xì)胞分裂增生、分泌ECM等機(jī)制，促進(jìn)纖維化的發(fā)生［7］。人體和動物實驗表明，與對照組比較，肝硬化組內(nèi)血漿腎素濃度和活性以及它的作用底物血管緊張素原的濃度和活性都有所增加［8］。血管緊張素Ⅱ在正常動物中既存在于血漿又可存在于肝組織中，在鼠肝病模型和肝硬化患者中，血管緊張素Ⅱ含量顯著增加［9］。血管緊張素Ⅱ是肝纖維化形成的主要介質(zhì)之一，它既參與了炎癥細(xì)胞的聚集［10］，又參與了肝星狀細(xì)胞活化表型的轉(zhuǎn)變［1］。醛固酮是纖維化的重要發(fā)病因素［11］。研究表明，醛固酮作用于肝星狀細(xì)胞株HSC-T6 48 h后可以促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及組織金屬蛋白酶抑制因子的表達(dá)(呈劑量依賴性)，發(fā)揮促肝纖維化的作用［12］。

近年認(rèn)識到肝纖維化甚至肝硬化在去除病因、經(jīng)過恰當(dāng)治療后可能逆轉(zhuǎn)［13］。雖然RAAS系統(tǒng)在肝病中的作用還沒有被完全闡明，但RAAS可能是抗肝纖維化治療的潛在靶點。

CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)某些方面與人肝纖維化相似［14］。本實驗運用CCl4誘導(dǎo)制備大鼠肝纖維化模型，病理學(xué)檢查顯示，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維化程度高于正常組;卡托普利組、氯沙坦組和螺內(nèi)酯組肝纖維化程度相近，均較模型組明顯減輕，提示阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)對肝纖維化大鼠具有相同的抑制肝纖維化的作用。

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