郭小凡,范長春,曹學(xué)成,蔡錦方
(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南250001;2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院)
聚磷酸鈣(CPP)是一種無機(jī)聚合物,具有生物相容性好、力學(xué)強(qiáng)度高、可降解和有骨傳導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn)[1~4]。在體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),植入多孔CPP中的軟骨細(xì)胞不易骨化并表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)和形態(tài)[5]。殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖,可被動(dòng)物體內(nèi)的溶菌酶等降解為氨基葡萄糖而被機(jī)體吸收,可以用于骨的重建和組織工程學(xué)等[6]。經(jīng)殼聚糖復(fù)合的多孔CPP生物陶瓷具有更好的力學(xué)特性和生物相容性[7]。2011年6月~2012年6月,我們將殼聚糖制成殼聚糖微球,涂布于自行加工的多孔CPP生物陶瓷表面,形成殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷,并將其與兔成骨細(xì)胞復(fù)合,以制作一種能用于骨缺損治療的生物材料。
1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 成年新西蘭大白兔1只,6個(gè)月齡,體質(zhì)量2.3 kg(由濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。WDW-10電子式萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(試金集團(tuán)濟(jì)南試驗(yàn)機(jī)廠);倒置顯微鏡 ,電子顯微鏡,O-lympus AU2700型生化監(jiān)測儀,全自動(dòng)生化分析儀。磷酸二氫鈣(分析純,天津市博迪化工公司),殼聚糖粉末(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司,脫乙酰度≥90%),DMEM培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)公司),0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibico公司)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 殼聚糖微球的制備 采用乳液凝固法合成殼聚糖微粒[8]。將一定量的殼聚糖加入醋酸中溶解后,加入200 mL液體石蠟中,恒溫恒速攪拌,加入適量乳化劑和交聯(lián)劑。靜置冷卻后分別采用石油醚、乙醇、去離子水去除石蠟、醋酸等化學(xué)物質(zhì),得到淡黃色殼聚糖微球。分別過0.45、0.22 mm分子篩后得到所需孔徑的殼聚糖微球。
1.2.2 多孔CPP的制備及結(jié)構(gòu)檢測 采用微球堆積法制備多孔CPP[5]。將一定量的磷酸二氫鈣保溫煅燒10 h后球磨,真空干燥后得到CPP燒料粉末。將粉末加入水及穩(wěn)定劑、殼聚糖微球,混合后成為料漿。烘干后在高溫下(約950℃)煅燒1 h,得到多孔CPP生物陶瓷。經(jīng)磨削切割后,在光鏡下觀察其內(nèi)部貫通情況。用排水法測量多孔CPP的孔隙率。
1.2.3 殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的制備將一定量殼聚糖微球加入100 mL的2%醋酸中,加入一定量致孔劑,超聲混勻后涂布于CPP生物陶瓷表面,干燥后以氫氧化鈉溶液去除其內(nèi)的醋酸,丙酮除去致孔劑,得到殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷。
1.2.4 殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的生物力學(xué)檢測 將CPP生物陶瓷以機(jī)器切割成為15 mm×4 mm×4 mm的長方體(后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以該尺寸進(jìn)行),將其置入WDW-10電子式萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行力學(xué)測試,檢測其各方向受壓形變程度以及垂直抗壓強(qiáng)度。共測試11個(gè)試樣(其中1個(gè)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于掃描電鏡拍照),取均值。
1.2.5 兔成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定 抽取兔骨髓10 mL,加入DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基20 mL,懸液經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過濾后,接種于2個(gè)50 mL培養(yǎng)瓶中,在5%CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng),每隔2 d換液1次,前3次半量換液,以后采用全量,同時(shí)棄去紅細(xì)胞等未貼壁細(xì)胞。約2周得到貼壁生長的單層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)。待其接近融合時(shí),用胰蛋白酶、EDTA消化,一分為二傳代。取體外傳代培養(yǎng)的第3代BMSC,將其分至11個(gè)培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中(其中1個(gè)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)用于掃描電鏡拍照)。分別在11個(gè)DMEM培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑(地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、胎牛血清)使其向成骨細(xì)胞分化。將接種有成骨細(xì)胞的蓋玻片用多聚甲醛固定,行HE染色光鏡形態(tài)觀察并進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。
1.2.6 成骨細(xì)胞與殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的復(fù)合方法 將已經(jīng)制備完成的殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷進(jìn)行γ射線消毒后,分別放入成功分化的11組成骨細(xì)胞中,使成骨細(xì)胞與殼聚糖包裹的CPP陶瓷復(fù)合。培養(yǎng)至第6天時(shí),取出其中1組多孔CPP生物陶瓷,PBS沖洗3遍,2%戊二醛固定,丙酮脫水,乙酸異戊酯置換,臨界點(diǎn)干燥,表面噴金后,掃描電鏡觀察陶瓷表面形態(tài)及成骨細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)至第9天時(shí),取出剩余10組CPP生物陶瓷,倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察成骨細(xì)胞形態(tài)和生長情況。在CPP生物陶瓷放入培養(yǎng)基后的第0、3、6、9天,用Olympus AU2700型生化監(jiān)測儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP水平,用全自動(dòng)生化分析儀檢測Ca2+和PO3-4含量。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,用OneWay ANOVA分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 多孔CPP生物陶瓷形態(tài)觀察及包裹殼聚糖后的生物力學(xué)性能測試 光鏡下,可見CPP陶瓷各部分性狀均一,孔徑的分布較為均勻。經(jīng)磨削切割后光鏡觀察見其內(nèi)部成孔良好、均勻,貫通性較好,見圖1??紫堵蕿?46.2±0.6)%。殼聚糖微球?yàn)榈S色分布均勻的顆粒,微球粒徑約200~400 μm。殼聚糖膜包裹后的多孔CPP生物陶瓷負(fù)荷—形變曲線見圖2,其抗壓強(qiáng)度為400 MPa。
圖1 多孔CPP生物陶瓷內(nèi)部結(jié)構(gòu)(光鏡,×500)
2.2 成骨細(xì)胞的鑒定 成功分離培養(yǎng)出兔BMSC,并誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞。HE染色光鏡下見細(xì)胞有多邊形、三角形、長梭形、星形等,有多個(gè)大小不一、互相連接的樹狀突起并與周圍細(xì)胞形成連接,胞核呈橢圓形,略嗜堿性,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有較多顆粒,具有較典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。ALP染色見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在中等量黑色物質(zhì),說明BMSC已分化為成骨細(xì)胞,分泌ALP。
圖2 多孔CPP生物陶瓷負(fù)荷—形變曲線
2.3 成骨細(xì)胞與殼聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷復(fù)合情況
2.3.1 復(fù)合后細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP的變化 各組細(xì)胞培養(yǎng)液第0、3、6、9天的ALP依次增高,分別為0、(20.0 ±2.94)、(28.9 ±1.66)、(36.2 ±4.14)μL,P均<0.01,成骨細(xì)胞在殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷上生長過程中所產(chǎn)生的ALP逐漸升高。
2.3.3 復(fù)合后成骨細(xì)胞形態(tài)和生長情況 電鏡檢查示成骨細(xì)胞與殼聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷復(fù)合良好,在CPP內(nèi)部的孔隙中,成骨細(xì)胞分布均勻,能在殼聚糖包裹的CPP內(nèi)表面正常生長增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì),見圖3。
圖3 復(fù)合成骨細(xì)胞后殼聚糖包裹的CPP表面形態(tài)(電鏡,×2 000)
殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷是當(dāng)前骨組織工程學(xué)研究的重點(diǎn)。作為兩種材料——?dú)ぞ厶桥cCPP的復(fù)合體,它集合了兩者對促進(jìn)骨骼修復(fù)的諸多優(yōu)點(diǎn)。多孔CPP可以作為整個(gè)生物陶瓷的支架,是整個(gè)骨骼力學(xué)撐重的支架,實(shí)驗(yàn)中該生物陶瓷抗壓強(qiáng)度達(dá)到400 MPa,遠(yuǎn)超過同等情況骨皮質(zhì)的抗壓程度[9],提示該生物陶瓷的強(qiáng)度足以替代骨骼,同時(shí)它也通過內(nèi)部分布均勻的孔道為成骨細(xì)胞的生長及分泌基質(zhì)提供了一個(gè)三維空間支架。包裹在多孔CPP之上的殼聚糖則扮演了生物相容性外衣的角色,具有止血、抗感染、可塑性和黏附性好等優(yōu)點(diǎn),可以幫助修復(fù)材料植入生物體內(nèi)后與機(jī)體反應(yīng)更加溫和。
本研究所制備的 CPP孔隙率約為(46.2±0.6)%,內(nèi)部結(jié)構(gòu)良好,孔隙分布均勻,貫通性好,有利于成骨細(xì)胞生長。另一方面,CPP的分解產(chǎn)物(Ca2+、PO3-4)是成骨細(xì)胞合成骨質(zhì)的必需原料,也有助于骨骼合成。在本研究中,我們對成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的Ca2+和PO3-4進(jìn)行了檢測,由于實(shí)驗(yàn)中沒有向培養(yǎng)液中加入鈣離子與磷離子,而且CPP中的鈣磷溶于水的量極少,可以忽略,因此第0天細(xì)胞培養(yǎng)液中并未檢測到鈣磷離子,而第3、6、9天時(shí)Ca2+和PO3-4的濃度為0.5~2 mmol/L,提示鈣磷離子是由成骨細(xì)胞分解CPP產(chǎn)生的,不但證明CPP可以為成骨細(xì)胞生長提供必需原料,也說明與殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷復(fù)合后的成骨細(xì)胞活性良好,具有分解CPP的能力。至于鈣磷含量的無規(guī)律上下波動(dòng)可能是由于不同培養(yǎng)瓶中的成骨細(xì)胞生長速度、代謝水平不相同,使得它們利用鈣磷以及分解CPP的速率不同而致,也可能是由于不同培養(yǎng)瓶中殼聚糖包裹的CPP表面積(包括其內(nèi)部孔隙的面積)不同使得成骨細(xì)胞總分解速率不同所致。
BMSC是一類具有自我復(fù)制能力以及分化潛能的干細(xì)胞,通過改變其誘導(dǎo)環(huán)境,能夠使其分化成為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。BMSC的另一優(yōu)勢是可以隨時(shí)直接從活體取材而不影響供體健康,這就提供了將復(fù)合這種細(xì)胞的生物陶瓷應(yīng)用到人類骨缺損治療中的臨床可行性。本研究中,我們通過對細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP、進(jìn)行檢測,并用掃描電鏡對成骨細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,評估BMSC誘導(dǎo)出的成骨細(xì)胞與殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷復(fù)合的生物相容性。ALP是成骨細(xì)胞分化和功能的標(biāo)志。研究表明,骨組織中發(fā)生鈣化的部位有ALP活性,說明ALP與骨組織的鈣化過程有關(guān)。因此,ALP的檢測能夠反映成骨細(xì)胞在生物陶瓷上的生長情況及有無骨質(zhì)合成。本研究結(jié)果顯示,第0、3、6、9天細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP逐漸升高,說明成骨細(xì)胞功能良好并且進(jìn)行了骨質(zhì)合成。之前討論已論述,的出現(xiàn)提示成骨細(xì)胞對多孔CPP具有分解作用,證明了成骨細(xì)胞活性良好,并且處于分泌基質(zhì)所必需的原料)充足環(huán)境之中。電鏡下可見在包裹殼聚糖多孔CPP的孔道內(nèi),成骨細(xì)胞較均勻地生長于其內(nèi),形態(tài)良好,并且可見細(xì)胞外基質(zhì),提示成骨細(xì)胞可以正常地在這種生物陶瓷上生長。
本實(shí)驗(yàn)是在體外環(huán)境中進(jìn)行的,而生物體的內(nèi)環(huán)境含有非常復(fù)雜的生物環(huán)境,是體外實(shí)驗(yàn)無法模仿的,因此復(fù)合有成骨細(xì)胞的殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷在生物體內(nèi)的功能表現(xiàn)尚需進(jìn)一步研究。
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