新的雜合肽抗腫瘤血管生成的作用機(jī)制

孫 波 周 悅 劉紅建 周慶偉 (吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

目前對(duì)腫瘤患者常見的化療和放療手段往往導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，因此尋找高效、低毒的抗腫瘤新藥是近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。小分子多肽廣泛存在自然界，并可通過(guò)人工方法合成，由于其具有分子量小、活性高、毒性低等特點(diǎn)〔1〕。這些腫瘤抑制肽主要是通過(guò)直接抑制腫瘤生長(zhǎng)作用、抑制腫瘤新生血管生成、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔3～5〕，在腫瘤的臨床治療上有重要價(jià)值。本研究基于目前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，設(shè)計(jì)、合成新的雜合肽是由血小板反應(yīng)蛋白-1和血管抑素的血管生成抑制同源區(qū)域以串聯(lián)方式連接而成的。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察，證實(shí)了新的雜合肽具有明顯抑制Lewis腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，在體內(nèi)能夠抑制堿燒傷后兔角膜新生血管以及對(duì)C57BL/6N純系小鼠腫瘤血管生成的抑制作用，并在細(xì)胞水平和整體水平上研究結(jié)果具有一定相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6N及新西蘭大白兔雌雄各半(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供);細(xì)胞株(上海細(xì)胞研究所提供)，IMDM培養(yǎng)基、新生胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司);細(xì)胞株(上海細(xì)胞研究所);IMDM培養(yǎng)基、新生胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司);多肽合成儀ACT90(日本ACT公司);Flash中壓純化系統(tǒng)(Biotaga SPI，美國(guó));制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep400，美國(guó)Waters公司);質(zhì)譜儀電噴霧質(zhì)譜(FINNIGANMATLCQ，美國(guó) FINNIGAN公司);冷凍干燥機(jī)(德國(guó)CHRIST公司);裂隙燈、二氧化碳孵箱(日本SANYO公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)試 Lewis腫瘤細(xì)胞接種在96孔板上，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)4～5 h后，細(xì)胞更換1%HS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，并且在同一培養(yǎng)基上用各自的待測(cè)樣品(VEGF、SMP)培養(yǎng)孵育，藥物濃度分別為0.45 μmol/L、0.9 μmol/L、1.8 μmol/L，對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)終濃度為1 ng/ml，作用時(shí)間為24、48、72 h，通過(guò)比色試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞數(shù)，求出IC50值。

1.2.2 體外抗腫瘤細(xì)胞遷移活性測(cè)試 Lewis腫瘤細(xì)胞接種在直徑35 mm Petri培養(yǎng)皿上，細(xì)胞生長(zhǎng)聚集。在培養(yǎng)24 h后，使用細(xì)胞刮板作一個(gè)矩形缺損，細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗3次，并且用各自的待測(cè)樣品(VEGF、SMP)培養(yǎng)孵育，藥物濃度分別為 0.45 μmol/L、0.9 μmol/L、1.8 μmol/L，對(duì)照組加入PBS，VEGF終濃度為1 ng/ml。在細(xì)胞遷移48 h后，在缺損邊緣任意選擇三個(gè)區(qū)域，使用10倍倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 兔角膜堿燒傷模型制備 將24只大白兔用濃度為3%戊巴比妥鈉進(jìn)行兔耳外緣側(cè)靜脈注射(1 ml/kg)，將浸潤(rùn)1 min的1 mol/L氫氧化鈉濾紙片(直徑0.3 mm)置于兔左眼角膜中央10 s后取下濾紙片，然后立即用20 ml生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜1 min。然后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)組.角膜燒傷12 h后、對(duì)照組滴生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組滴不同的濃度藥液20 μl，藥物濃度分別為 30 μmol/次、60 μmol/次 120 μmol/次，所有兔右眼均滴生理鹽水作陰性對(duì)照。3次/d，連續(xù)21 d后，用裂隙燈觀察并攝影，并計(jì)算角膜新生血管生長(zhǎng)面積(A)，按公式A=C/12 ×3.1416〔r2-(r-L)2〕。

1.2.4 C57BL/6N純系小鼠腫瘤模型制備 選用6 w齡的C57BL/6N雄性小鼠40只，體重18～22 g，每鼠在左腹股溝皮下接種0.2 ml，細(xì)胞數(shù)為5×106后。隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)組，每組10只，接種瘤細(xì)胞后第二天開始在鼠腹股溝皮下注射給藥，藥物濃度分別為 30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L，每日一次，連續(xù)21 d，末次給藥后24 h處死動(dòng)物，取瘤塊并稱重，計(jì)算抑瘤率=〔1－給藥組平均瘤重(T)/對(duì)照組平均瘤重(C)〕×100﹪。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性 在培養(yǎng)24 h后依濃度觀察，濃度在0.45～1.8 μmol/L，衰老標(biāo)記蛋白(SMP)對(duì)Lewis細(xì)胞抑制能力開始上升，到培養(yǎng)48 h時(shí)達(dá)到最高抑制效果，與正常對(duì)照組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.05)，然后，在72 h開始下降，可見小分子雜合肽濃度與增殖抑制作用之間具有一定的時(shí)－效關(guān)系。見表1。

表1 小分子雜合肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞增殖的影響( ± s，n=5)

表1 小分子雜合肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞增殖的影響( ± s，n=5)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;下表同

0.556±0.364 0.482±0.013 0.465±0.035實(shí)驗(yàn)組0.45 μmol/L 0.436±0.048 0.228±0.0131) 0.485±0.0750.9 μmol/L 0.444±0.040 0.201±0.0141) 0.462±0.0421.8 μmol/L 0.348 ±0.035 0.179 ±0.0161)24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組組別0.392±0.066

2.2 體外抑制腫瘤細(xì)胞遷移活性 小分子雜合肽在不同藥物濃度下，能夠較明顯抑制Lewis腫瘤細(xì)胞遷移，并在濃度在(1.8 μmol/L)時(shí)，培養(yǎng)48 h抑制作用最為明顯，與正常對(duì)照組比較(P﹤0.01)，可見抑制細(xì)胞遷移數(shù)具有一定的劑量-依賴關(guān)系。見表2。

表2 小分子雜合肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞遷移的影響( ± s，n=3)

表2 小分子雜合肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞遷移的影響( ± s，n=3)

99.65±4.33實(shí)驗(yàn)組0.45 μmol/L 76.26 ±1.861)0.9 μmol/L 58.13 ±2.121)1.8 μmol/L 24.67 ±1.221)組別 細(xì)胞遷移數(shù)正常對(duì)照組

2.3 雜合肽對(duì)堿燒傷后兔角膜新生血管生成作用的影響 雜合肽藥物在不同濃度劑量下，連續(xù)眼內(nèi)滴藥7 d，藥物濃度分別在60～120 μmol/L次時(shí)，都具有較明顯的抑制兔角膜新生血管作用，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，并具有一定的量-效關(guān)系，但在第16天、第21天時(shí)，作用效果最為明顯，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。鏡下觀察，角膜水腫減輕，新生血管細(xì)小、稀疏，多集中于上、下角膜緣，呈緩慢性生長(zhǎng)，其作用靶點(diǎn)可能為血管內(nèi)皮細(xì)胞。從而抑制兔角膜新生血管。見表3。

表3 不同時(shí)間小分子雜合肽對(duì)堿燒傷后兔角膜新生血管生成的影響(x ±s，n=6，mm2)

2.4 小分子雜合肽對(duì)C57BL/6N荷瘤鼠腫瘤抑制作用 在腫瘤小鼠瘤邊處連續(xù)注射給藥21 d，藥物濃度為60～120 μmol/L時(shí)，雜合肽抑瘤效果特別明顯，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)，其抑制率為73.5%，其直接作用靶點(diǎn)可能為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，使實(shí)體瘤無(wú)法獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。見表4。

表4 小分子雜合肽對(duì)C57BL/6N腫瘤小鼠的抑制作用( ± s，n=10)

表4 小分子雜合肽對(duì)C57BL/6N腫瘤小鼠的抑制作用( ± s，n=10)

組別 瘤重(g) 抑制率(%)1.60±0.45 0實(shí)驗(yàn)組30 μmol/L 0.77 ±0.121) 51.860 μmol/L 0.57 ±0.451) 64.3120 μmol/L 0.43 ±0.281)正常對(duì)照組73.5

3 討論

在腫瘤治療中，盡管傳統(tǒng)的放、化療已取得了很大進(jìn)展，但由于其在殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)，也對(duì)人體產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，其中主要是骨髓抑制、免疫功能低下和腫瘤多藥耐藥。天然生物活性肽是一類存在動(dòng)物、植物、微生物等生物體內(nèi)經(jīng)特殊提取分離工藝能直接得到的一類生物活性肽其中有一些在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中具有顯著抗腫瘤作用〔5〕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者試圖從天然物質(zhì)中獲取具有單一活性抗腫瘤多肽，已克服現(xiàn)有藥物不良反應(yīng)及腫瘤耐藥性。與傳統(tǒng)的化療和放療相比，天然抗腫瘤活性多肽最大優(yōu)點(diǎn)在于分子量小、活性高、不良反應(yīng)小、易于多途徑吸收、不易產(chǎn)生耐藥性。它們可針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)，特異性殺傷、抑制腫瘤細(xì)胞，顯示出極好的應(yīng)用前景?；谀壳把苌呻难芯窟M(jìn)展，本研究設(shè)計(jì)并合成的小分子雜合肽通過(guò)建立Lewis肺癌皮下移植瘤及堿燒傷后兔角膜新生血管模型來(lái)探討小分子肽對(duì)新生血管的抑制作用。研究顯示，在瘤體邊緣每天注射小分子雜合肽及兔角膜眼內(nèi)滴藥濃度在120 μmol/L，并連續(xù)給藥21 d，能明顯抑制堿燒傷后兔角膜及腫瘤新生血管生成，使瘤體明顯縮小，抑制率為73.5%，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，抑瘤效應(yīng)隨著藥物劑量的增加抑制率逐漸增大，結(jié)果證實(shí)了新的雜合肽抑制腫瘤血管退化同時(shí)，可以引起瘤體的消退，使腫瘤體積明顯縮小，體重外周血白細(xì)胞數(shù)量及未見明顯變化，無(wú)異常反應(yīng)及死亡。結(jié)果提示，新的雜合肽是一種安全、有效、無(wú)毒副作用的血管生成抑制劑。

有研究表明，大部分治療腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞，一個(gè)突出的問(wèn)題既產(chǎn)生耐藥性。而內(nèi)皮細(xì)胞具有一套正常的、完整的染色體，具有穩(wěn)定的遺傳性，因而通過(guò)血管生成抑制因子治療腫瘤不易產(chǎn)生耐藥性〔6〕。內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成的首要步驟，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，也就有效的抑制血管的形成。針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞這一特點(diǎn)，本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究新的雜合肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移活性的影響，結(jié)果表明，新的雜合肽能明顯抑制Lewis腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移，當(dāng)濃度為1.8 μmol/L并作用48 h時(shí)，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移明顯被抑制，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，此結(jié)果證實(shí)了新的雜合肽可能直接作用與運(yùn)動(dòng)的及增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在48 h作用最明顯。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)此已證實(shí)。并且，在細(xì)胞水平和整體水平上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果上具有一定相關(guān)性，其作用機(jī)制可能直接作用靶點(diǎn)為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。使實(shí)體瘤無(wú)法獲得足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，來(lái)抑制腫瘤血管生成，使腫瘤處于無(wú)血管期，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本文中新的雜合肽有望成為一種高效、低毒，易得的抗腫瘤血管生成抑制劑。

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