芳香化酶基因敲除小鼠肝組織PPARα表達(dá)及與肝脂肪變性的關(guān)系

宋漢香 王淑秋 呂少春 戶田藤巳 西原利治 魯 燕 宋漢君

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

雌激素在調(diào)節(jié)糖和脂質(zhì)代謝方面的重要性已通過(guò)對(duì)芳香化酶基因敲除小鼠(ArKO)的研究得到進(jìn)一步證實(shí)，即ArKO小鼠更易發(fā)展為肝脂肪變性〔1〕。過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和能量平衡，其中PPARα調(diào)控許多基因的表達(dá)，葡萄糖6磷酸酶(G6pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)等是糖異生的關(guān)鍵酶，對(duì)糖和脂質(zhì)代謝起著關(guān)鍵作用，其激活可使肝臟生成葡萄糖增多，進(jìn)一步導(dǎo)致游離脂肪酸增多，成為胰島素抵抗(IR)的原因之一〔2〕。盡管已知PPARα在糖和脂質(zhì)代謝中的幾個(gè)機(jī)制，但在雌激素缺乏的動(dòng)物體內(nèi)，PPARα是否可以改善肝臟的脂代謝狀況目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本文擬探討在雌激素缺乏的小鼠體內(nèi)，PPARα對(duì)肝臟脂代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 36只6周齡雄性小鼠，分為野生型(WT)組、ArKO 組、PPARα 基 因 敲 除 (PPARαKO)組、ArKO/PPARαKO組，每組9只。實(shí)驗(yàn)小鼠的管理依據(jù)日本高知大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物管理準(zhǔn)則執(zhí)行，所有小鼠維持在22℃ ～25℃的12 h晝夜(光照/黑暗)循環(huán)下，并給予隨意飲水和植物雌激素含量低的嚙齒目動(dòng)物飼料(NIH－07PLD，日本東京東方酵母股份有限公司提供)。CYP19(芳香化酶P450基因)通過(guò)同源重組、重復(fù)回交(雜交)達(dá)到統(tǒng)一化的 C57BL/6J遺傳背景〔3〕，再以CYP19雜合小鼠(Ar+/－)雜交生產(chǎn)出 ArKO鼠。PPARαKO小鼠購(gòu)于Jackson實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)PPARαKO小鼠與Ar+/－小鼠的重復(fù)雜交，生產(chǎn)出 Ar+/－/PPARαKO。然后，通過(guò)Ar+/－小鼠與PPARα基因型雜交獲得 ArKO/PPARαKO小鼠。各組實(shí)驗(yàn)小鼠均從6周齡開始每2周測(cè)定一次小鼠體重并記錄每天食物攝入量。各組小鼠無(wú)疾病和死亡。

1.2 主要試劑 DNA聚合酶(5 U/μl)及Ribonuclease inhibi－tor(RB)均購(gòu)自Bio Basic公司，RNA反轉(zhuǎn)錄酶MMLV購(gòu)自Invitrogen corporation 公司，規(guī)格 200 U/μl。

1.3 方法

1.3.1 肝組織病理學(xué)觀察 在各組實(shí)驗(yàn)小鼠2、3、4、5月齡時(shí)，分別隨機(jī)處死各1只小鼠，取小鼠肝組織，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色作肝組織病理學(xué)觀察。

1.3.2 肝組織總RNA的提取 (1)從各組剩余的5月齡小鼠肝臟提取全部RNA。(2)在25 μl終體積反應(yīng)中使用200 U MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca9，2008，USA)行全部RNA的反轉(zhuǎn)錄(37℃1 h，根據(jù)試劑說(shuō)明書操作)。(3)在一個(gè)光循環(huán)儀器(Takara Bio inc，Shiga Japan)內(nèi)使用終體積為12.5 μl的SYBR Primers Ex TaqTMⅡ，以16 ng反轉(zhuǎn)錄的全部RNA為起始點(diǎn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量－聚合酶鏈反應(yīng)(QRT－PCR)技術(shù)對(duì)四組不同基因型小鼠肝組織的五種基因(Gluk，PEPCK，G6pase，GLUT2，Pyrk)進(jìn)行 mRNA 定量分析。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成 Gluk(NM－00111268)前導(dǎo)鏈:5′－CCCAACTGCGAAATCACCT－3′，反轉(zhuǎn)鏈:5′－CATTTGTGGGGTGTGGAGT－3′;PEPCK(NM－011044)前導(dǎo)鏈:5′－CACCAACGTGGCTGAGACTA－3′，反 轉(zhuǎn) 鏈:5′－CTACGGCCACCAAAGATGAT－3′;G6pase(NM－008061) 前導(dǎo)鏈:5′－TGAAACTTTCAGCCACATCCG－3′，反轉(zhuǎn)鏈:5′－GCAGGTAGAATCCAAGCGCGAA－3′;GLUT2(NM－031197) 前導(dǎo)鏈:5′－CCTACGGCTCTGGCACTGG－3′，反轉(zhuǎn)鏈:5′－GACTTTCCTTTGGTTTCTG－3′;Pyrk liver(NM－000292)前導(dǎo)鏈:5′－TACCACCGCCAGTTGTTTG－3′， 反 轉(zhuǎn) 鏈: 5′－GCGGCCAGTCTTTGTCAGC－3′;對(duì)照引物 cyclophilin A(NM－008907)前導(dǎo)鏈:5′－ATGGCACTGGCGGCAGGTCC－3′，反轉(zhuǎn)鏈:5′－TTGCCATTCCTGGACCCAAA－3′〔4〕。所給基因的相對(duì)定量值以 Cyclophilin mRNA的值為基準(zhǔn)。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性10 min后，94℃變性30 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸3 min，循環(huán) 35 次，72℃ 延伸2 min，終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為230 bp。

1.3.5 PCR產(chǎn)物電泳 制作20%聚丙烯酰胺凝膠，取一份5 μl Marker和 4 μl各組 PCR 產(chǎn)物加樣，電壓為 110 V，電泳45 min。然后用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察并攝片保存。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)期間WT組小鼠活動(dòng)度好，飲食正常，皮毛整潔，體重不同程度增加。6周齡時(shí)四種基因型小鼠體重相似。2月齡時(shí)，PPARαKO組、ArKO/PPARαKO組分別與WT組比較，食物攝入量均明顯增加(P＜0.05);ArKO/PPARαKO組與ArKO組比較，前者食物攝入量增加明顯(P＜0.05)。5月齡時(shí)，ArKO組、PPARαKO組、ArKO/PPARαKO組小鼠體重相似但均明顯高于 WT組〔WT組:(32.2±2.1)g vs ArKO組:(40.1±1.4)g，P ＜0.05;vs.PPARαKO 組:(37.9 ±1.6)g，P ＜0.06;vs ArKO/PPARαKO組:(40.1±0.8)g，P＜0.01〕。然而，5月齡時(shí)與WT組比較，只有PPARαKO組攝食量明顯增加(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠未發(fā)生意外死亡。見圖1。

2.2 肝組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)觀察

2.2.1 大體形態(tài) 5月齡時(shí)，WT組小鼠肝臟形態(tài)正常，其他各組小鼠肝臟均較WT組增大，包膜緊張，邊緣較鈍，質(zhì)地略軟，色變黃，表面呈花斑狀，有油膩感。ArKO/PPARαKO組較其他各組小鼠肝脂肪變性程度嚴(yán)重。

2.2.2 光鏡觀察 本實(shí)驗(yàn)中，50%的5月齡ArKO小鼠肝細(xì)胞發(fā)生輕度肝脂肪變性。PPARαKO組小鼠3月齡時(shí)肝細(xì)胞即全部發(fā)展成脂肪變性，WT組小鼠未見肝脂肪變性，ArKO/PPARαKO組小鼠在5月齡時(shí)肝脂肪變性明顯。見圖2。

圖1 不同時(shí)間段各組小鼠體重變化

2.3 五種基因的表達(dá)分析 Gluk、PEPCK和G6pase在后三組小鼠肝組織中的表達(dá)水平均明顯高于 WT組，且 ArKO/PPARαKO組均較ArKO組顯著增高(P＜0.05)。Gluk表達(dá)水平在ArKO鼠和PPARαKO鼠無(wú)明顯差異(P＞0.05);PEPCK表達(dá)水平在PPARαKO鼠較ArKO鼠顯著增高(P＜0.01);G6pase表達(dá)水平在ArKO鼠較PPARαKO鼠增高(P＜0.05)。然而，在四組實(shí)驗(yàn)小鼠中，GLUT2和Pyrk基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異。見圖3，表1。

表15 月齡四組小鼠 Gluk、PEPCK、G6pase、GLUT2、Pyrk mRNA的表達(dá)( ± s，n=6)

表15 月齡四組小鼠 Gluk、PEPCK、G6pase、GLUT2、Pyrk mRNA的表達(dá)( ± s，n=6)

與WT組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與ArKO/PPARαKO組比較:3)P＜0.01

1.0017±0.0041 1.0017±0.0041 ArKO組 1.1717±0.04832) 1.1497±0.08211)3) 1.5250±0.12242) 0.9402±0.0801 0.9087±0.2030 PPARαKO組 1.2183±0.06402) 1.3133±0.13542)3) 1.2285±0.17182) 1.0087±0.1188 1.1115±0.1706 ArKO/PPARαKO組 1.7940±0.13432) 1.6750±0.12852) 1.8167±0.09712)Gluk PEPCK G6pase GLUT2 Pyrk WT組 1.0017±0.0041 1.0017±0.0041 1.0017±0.0041組1.0650±0.1108 1.0035±0.1886

圖2 肝組織切片HE染色觀察5月齡時(shí)各組小鼠肝臟病理改變(HE，×400)

a:Gluk;b:PEPCK;c:G6pase;d:GLUT2;e:PyrkM:marker;1:WT組;2:Arko組;3:PPARαKO 組;4:ArKO/PPARαKO組

3 討論

在ArKO基因工程研究領(lǐng)域，雌激素參與碳水化合物和脂質(zhì)代謝的作用已經(jīng)得到詳細(xì)闡述〔5，6〕，CYP19屬于細(xì)胞色素P450超家族成員，可編碼一種酶，催化多種哺乳動(dòng)物組織的雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化〔7〕。日本的戶田滕巳通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證明了CYP19的分裂引起脂質(zhì)和葡萄糖代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗和在性二相性方式中肝脂肪變性的發(fā)展;補(bǔ)充17－β雌二醇 (E2)可使代謝活性調(diào)節(jié)恢復(fù)，進(jìn)而使代謝參數(shù)恢復(fù)到野生型 (WT)小鼠的水平〔7〕。

PPARs是配體激活核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，PPAR是其中的一個(gè)亞型，其分布具有高度的組織選擇性，主要在肝臟和棕色脂肪組織中高表達(dá)。PPARα調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，而這些基因?qū)μ谴x及脂質(zhì)代謝起關(guān)鍵作用:①PPARα調(diào)節(jié)了β類藥物對(duì)脂質(zhì)代謝的降血脂效應(yīng);②PPARα參與了肥胖的調(diào)節(jié);③PPARα的活化作用也改善了葡萄糖和能量平衡，抑制血管炎癥和糾正年齡相關(guān)性的調(diào)節(jié)障礙〔8～10〕。

肝臟脂肪變性是代謝綜合征的表現(xiàn)之一，脂肪代謝過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙都可引起肝細(xì)胞脂肪變性?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體β－氧化途徑中的一些酶類，介導(dǎo)載脂蛋白apoA I表達(dá)，促進(jìn)脂蛋白脂肪酶合成，催化脂蛋白中的甘油三酯分解為游離脂肪酸〔11〕。PPARα還可以調(diào)節(jié)若干線粒體脂肪酸催化酶的表達(dá)，促進(jìn)β－氧化過(guò)程，降低脂肪酸和甘油三酯的合成。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)糖代謝及脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的五種基因在四組不同基因型小鼠肝組織中的表達(dá)水平分別進(jìn)行QRT－PCR分析，觀察CYP19－ArKO小鼠體內(nèi)PPARα基因缺失是否會(huì)逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性。本研究結(jié)果顯示，芳香化酶基因失活產(chǎn)生的肝臟脂肪變性程度不但沒有被PPARα基因的去除所改善，反而被加重。這一結(jié)果表明PPARα調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑有利于生理?xiàng)l件下雌激素缺乏時(shí)的糖代謝和脂質(zhì)代謝。

因此，在缺乏雌激素的小鼠體內(nèi)，PPARα基因的表達(dá)信號(hào)對(duì)于維持肝細(xì)胞正常的糖代謝及脂質(zhì)代謝起著重要作用。但小鼠PPARα基因調(diào)控肝細(xì)胞正常的糖代謝及脂質(zhì)代謝的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有必要進(jìn)一步研究。

1 Jones ME，Thorburn AW，Britt KL，et al.Aromatase－deficient(ArKO)mice accumulate excess adipose tissue〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2001;79(1－5):3－9.

2 Kersten S，Desvergne B，Wahli W.Roles of PPARs in health and desease〔J〕.Nature，2000;405(6785):421－4.

3 Toda K，Okada T，Hayashi Y，et al.Preserved tissue structure of efferentductules in aromatase deficient mice〔J〕.J Endocrinol，2008;199:137－46.

4 Dentin R，Pégorier JP，Benhamed F，et al.Hepatic glucokinase is required for the synergistic action of ChREBP and SREBP－1c on glycolytic and lipogenic gene expression〔J〕.J Biol Chem，2004;279:20314－26.

5 Nemoto Y，Toda K，Ono M，et al.Altered expression of fatty acid－metabolizing enzymes in aromatase－deficient mice〔J〕.J Clin Invest，2000;105:1819－25.

6 Hewitt KN，Pratis K，Jones ME，et al.Estrogen replacement reverses the hepatic steatosis phenotype in the male aromatase knockout mouse〔J〕.Endocrinology，2004;145:1842－8.

7 Takeda K，Toda K，Saibara T，et al.Progressive development of insulin resistance phenotype in male mice with complete aromatase(CYP19)deficiency〔J〕.J Endocrinol，2003;176:237－46.

8 Zhang F，Lavan B，Gregoire FM.Peroxisome proliferator－activated receptors as attractive antiobesity targets〔J〕.Drug News Perspect，2004;17:661－9.

9 Chen X，Matthews J，Zhou L，et al.Improvement of dyslipidemia，insulin sensitivity，and energy balance by a peroxisome proliferator－activated re－ceptor alpha agonist〔J〕.Metabolism，2008;57:1516－25.

10 Pineda TI，Gervois P，Staels B.Peroxisome proliferator－activated receptor α in metabolic disease，inflammation，atherosclerosis and aging〔J〕.Curr Opin Lipidol，1999;10:151－9.

11 Nemoto Y，Toda K，Ono M，et al.Altered expression of fatty acid－metabolizing enzymes in aromatasedeficient mice〔J〕.J Clin Invest，2000;105:1819－25.