生地－山茱萸對糖尿病大鼠血管的保護作用

劉 斌 許惠琴 吳 誠 吳佳蕾 農(nóng)偉虎 李 偉 陶玉菡

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210046)

糖尿病血管病變尤其是微血管病變是糖尿病多種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，可造成多種器官(腎臟、眼、心臟、皮膚)的病理性損傷，它嚴重影響了糖尿病人的預(yù)后和生存，血管內(nèi)皮細胞的損傷可能是血管病變的一個重要原因〔1〕，而一氧化氮(NO)/內(nèi)皮素(ET)和血栓素A2(TXA2)/前列腺環(huán)素A2(PGI2)是兩組血管活性物質(zhì)，由血管內(nèi)皮細胞合成、分泌。兩組動態(tài)平衡對維持內(nèi)皮細胞的正常功能及對血流動力學(xué)等起著重要作用。正常情況下，機體氧化自由基的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)處在一個動態(tài)平衡中，機體依靠提高某些酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等的產(chǎn)量，消除過多的自由基，保護組織、細胞免受損傷〔2〕。一旦酶活力下降，將引起體內(nèi)自由基的大量蓄積，最終引起廣泛的自由基損傷。本實驗初步探討生地-山茱萸藥對保護糖尿病血管病變的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及飼料 清潔級雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號碼:SCXK(滬):2007-0005;普通飼料;高脂飼料普通飼料74.5%、蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇0.5%，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.2 藥物及試劑 生地:河南南陽西峽，河南宛西制藥有限公司批號0900161;山茱萸:河南焦作武陟，河南宛西制藥有限公司批號1000021;以上藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，分別為玄參科多年生草本植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥的塊根和山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。鏈脲佐菌素(STZ)，SIGMA，批號:101025;檸檬酸，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠，批號:20030801;檸檬酸三鈉，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號:090324;戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥 (集團)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號:F20021216。肝素鈉，上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號:090725;戊二醛，中國醫(yī)藥 (集團)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號:20001026。鹽酸氨基胍 (AG)，純度98%，SIGMA，批號:MW09081;格列美脲片 (亞莫利)，賽諾菲安萬特 (北京)制藥有限公司，批號:B00006。生地-山茱萸藥對 (2∶1)為北京中醫(yī)藥大學(xué)趙進喜教授臨床驗方，主治因糖尿病引發(fā)的各類血管并發(fā)癥，隨癥加減，具有獨特的療效。生地 (SD):取生地濃縮液133.3 ml溶于500 ml蒸餾水中，配成相當于0.24 g生藥/ml的溶液;山茱萸(SZY):取山茱萸濃縮液66.7 ml溶于500 ml蒸餾水中，配成相當于0.12 g生藥/ml的溶液;藥對總提高劑量 (TH-DP):取藥對總提物266.6 ml溶于500 ml蒸餾水中，配成相當于0.72 g生藥/ml的溶液;藥對水提高劑量 (AH-DP):取藥對水提物266.6 ml溶于500 ml蒸餾水中，配成相當于0.72 g生藥/ml的溶液;將藥對總提高劑量 (TL-DP)與藥對水提高劑量 (AL-DP)分別稀釋一倍得兩者低劑量溶液，分別配成相當于0.72 g生藥/ml的溶液;NO(硝酸還原酶法)試劑盒，批號:20100902;NOS(測總)試劑盒，批號:20101108;SOD(測總)試劑盒，批號:20101105。以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。內(nèi)皮素方面試劑盒，批號:20101105;6-酮-前列腺素 F1α放免藥盒，批號:20110106;血栓素B2放免藥盒，批號:20110105。以上試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 儀器及實驗條件 酶標儀 Synergy HT，BIO-TEK;血糖儀ACCU-CHEK，美國羅氏;電熱恒溫振蕩水槽 DKZ-2型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。用高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20℃ ～24℃，濕度40% ～70%。

1.4 方法

1.4.1 造模、分組及給藥 取雄性Wistar大鼠，高脂飼料喂養(yǎng)12 w，同時設(shè)立正常對照組，并以普通飼料喂養(yǎng)。造模前禁食12 h，按20 mg/kg體重一次性ip.上述配制好的5 mg/ml STZ溶液，正常組大鼠ip.檸檬酸緩沖液;1 w后，大鼠禁食12 h后，測空腹血糖，選取7.0 mmol/L＜空腹血糖值＜20.0 mmol/L大鼠，作為糖尿病造模成功大鼠。

取模型成功大鼠按血糖值隨機分組，設(shè)立模型組、AG組(100 mg/kg)、格列美脲組(GLMN)0.4 mg/kg、生地組(SD)2.4 g/kg、山茱萸組(SZY)1.2 g/kg、藥對總提低劑量組(TLDP)3.6 g/kg、藥對總提高劑量組(TH-DP)7.2 g/kg、藥對水提低劑量組(AL-DP)3.6 g/kg、藥對水提高劑量組(AH-DP)7.2 g/kg，以上大鼠均繼續(xù)喂以高脂飼料。另設(shè)正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng)。各組分別灌胃給藥上述劑量藥物12 w，模型組與正常對照組大鼠ig.蒸餾水。

1.4.2 指標測定 12 w末，禁食(不禁水)12 h，按體重2 ml/kg ip.3%戊巴比妥鈉溶液，待麻醉后，頸總動脈取血，以全血∶肝素(30∶0.1)分裝制備血漿，另取全血靜置，分離制備得血清。根據(jù)試劑盒說明書測定血清中NO(硝酸還原酶法)、TNOS和總SOD活力;放射免疫法測定血清中TXB2和6-keto-PGF1α及血漿中ET含量。

2 結(jié)果

2.1 對糖尿病大鼠NO、T-NOS、ET及NO/ET的影響 模型組大鼠NO含量與正常組比較略下降，給藥組NO均升高，其中生地組含量升高較為明顯，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。模型大鼠血清中T-NOS活力有下降趨勢，給藥組其活力值上升。模型大鼠ET含量升高，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);用藥組ET含量較模型組均有下降，其中藥對總提低劑量和水提高劑量兩組ET含量下降明顯，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，模型大鼠血清中NO/ET顯著降低，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，各給藥組上升較為明顯，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。提示藥物具有恢復(fù)血管收縮與舒張的動態(tài)平衡作用。見表1。

2.2 對糖尿病大鼠血清中TXB2、6-keto-PGF1α及兩者比值的影響 模型大鼠血清中總TXB2含量顯著升高，與正常組比較差異極顯著(P＜0.01)。用藥組均呈下降趨勢，其中藥對總提高劑量TXB2含量明顯下降，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。模型組大鼠血清中6-keto-PGF1α與正常組比較無明顯差異，氨基胍和格列美脲組下降較為明顯，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)，其他各組升高或降低都不明顯。模型大鼠血清中兩者含量之比顯著升高，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，氨基胍與格列美脲組比值仍處于較高水平，中藥組普遍降低，其中，生地-山茱萸藥對總提高劑量組下降較為明顯，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。見表2。與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

表1 對糖尿病大鼠NO、T-NOS、ET及NO/ET的影響(±s)

表1 對糖尿病大鼠NO、T-NOS、ET及NO/ET的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

NO/ET正常組 10 65.67±14.05 7.01±1.79 34.42±15.40 1.88±1組別 n NO(μmol/L)T-NOS(U/ml)ET(pg/ml).59模型組 12 58.60±31.13 6.08±1.33 54.11±17.971) 1.23±0.681)AG 11 78.10±38.44 7.56±2.96 48.55±12.35 1.66±0.842)GLMN 11 94.63±68.34 6.87±3.41 44.87±15.28 1.87±1.482)SD 9 86.90±26.672) 7.09±2.13 46.04±21.03 1.90±0.982)SZY 8 70.66±39.51 6.72±4.17 43.92±14.66 1.62±1.052)TL-DP 8 80.61±31.39 7.86±1.82 36.80±15.941)2)2.27±0.762)TH-DP 9 79.27±27.74 6.93±2.08 45.17±17.42 1.90±0.922)AL-DP 9 55.00±25.61 7.76±2.44 46.49±23.47 1.88±1.802)AH-DP 10 66.41±21.05 7.33±2.22 34.42±16.501)2) 2.53±1.872)

表2 對糖尿病大鼠血清中TXB2和6-keto-PGF1α及兩者比值的影響(±s)

表2 對糖尿病大鼠血清中TXB2和6-keto-PGF1α及兩者比值的影響(±s)

組別 n TXB2(pg/ml)6-keto-PGF1α(pg/ml)TXB2/6-keto-PGF1α 10 72.24±11.19 111.17±12.17 0.66±0.15模型組 12 94.64±13.361) 112.12±12.67 0.91±0.201)AG 11 84.86±10.57 92.87±16.642) 0.94±0.18 GLMN 11 97.62±13.35 88.33±14.542) 1.15±0.301)SD 9 88.39±21.77 102.15±7.67 0.87±0.21 SZY 8 99.85±20.30 107.28±26.56 0.98±0.27 TL-DP 8 86.65±18.90 108.39±14.67 0.82±0.23 TH-DP 9 78.50±10.532) 118.22±14.75 0.67±0.112)AL-DP 9 81.37±18.66 113.47±17.37 0.72±0.28正常組AH-DP 10 86.22±20.74 116.05±15.79 0.72±0.21

2.3 對糖尿病大鼠血清中總SOD活力的影響 模型大鼠血清中總 SOD活力〔(112.47±16.69)U/ml〕較正常組〔(130.01±8.43)U/ml〕顯著降低(P＜0.01)。AG組大鼠血清中SOD活力〔(133.33±7.25)U/ml〕較模型組明顯上升(P ＜ 0.01)，GLMN、SD、SZY、TL-DP、TH-DP、AL-DP、AH-DP 組SOD分別為:〔(111.29±14.18)，(112.89±8.33)，(121.22±6.52)，(121.99±9.24)，(123.12 ±7.34)，(117.58 ±14.52)，(120.42±14.99)U/ml〕均呈下降趨勢，結(jié)果提示藥物具有明顯的抗氧化作用。

3 討論

糖尿病血管病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，它嚴重影響病人的生存質(zhì)量。從糖尿病發(fā)生的演變過程表現(xiàn)為血管病變的演變過程，一旦高血糖達到臨床診斷標準，持續(xù)慢性的高血糖狀態(tài)便加速了糖尿病微血管和大血管病變的發(fā)展與惡化〔3，4〕。高血糖導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞損傷，激活凝血系統(tǒng)和血小板，形成微血栓，釋放生物活性物質(zhì)如內(nèi)皮素等，改變血管張力及血流動力學(xué)，破壞血管屏障，增加血管內(nèi)皮通透性，造成一系列病理改變〔5〕。

NO是內(nèi)皮細胞釋放的有效的血管擴張劑，被稱作內(nèi)皮源性舒張因子(EDRF)，在保持血管穩(wěn)態(tài)上起關(guān)鍵作用。NO還可抑制血小板的聚集、血管平滑肌的增殖以及抑制白細胞黏附于血管壁。NO的釋放減少或活性降低可能是血管功能障礙和動脈粥樣硬化形成的原因之一〔6〕。ET主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細胞〔7〕，腎臟既是ET合成代謝的重要場所，又是其主要的靶器官，因此血漿ET水平可反映腎臟受損的嚴重程度。NO可增加ET合成，相反ET則對NO的合成具有抑制作用。但有實驗表明，自發(fā)性糖尿病BB鼠離體培養(yǎng)的微動脈內(nèi)皮細胞NO合成速度明顯降低，僅為對照組的15%，這與該類鼠巨噬細胞生成的NO大量增加正好相反，這與臨床報道糖尿病患者血清中NO明顯增加的案例具有相似之處。其原因有學(xué)者認為長期高血糖可產(chǎn)生大量糖基化終產(chǎn)物，它可刺激相應(yīng)細胞如腎小球系膜細胞表達NOS，催化合成大量的NO;也有學(xué)者認為由于大量糖基化終產(chǎn)物產(chǎn)生，使NO滅活增多，又血管平滑肌對NO反應(yīng)減弱，可促使機體發(fā)揮代償機制合成大量NO〔8〕。這種代償性的NO增多建立在大量自由基的蓄積上，由于此代償作用，可誘導(dǎo)SOD合成增加。Dominguez等〔9〕發(fā)現(xiàn)Ⅰ型糖尿病患者早期血清SOD值較正常人顯著升高，而GSH-Px及過氧化氫酶含量卻降低。然而隨著糖尿病病程的延長，由于終末糖化產(chǎn)物的增多，機體的這種代償能力逐漸減弱;且由于谷胱甘肽過氧化物酶含量的降低造成H2O2的蓄積對SOD的合成也具有抑制作用。TXA2和PGI2是近年發(fā)現(xiàn)的生理活性極強、作用完全相反的血管活性物質(zhì)，TXA2/PGI2的動態(tài)平衡是調(diào)節(jié)血管壁緊張度、血小板功能及血管壁細胞遷移生長的重要因素，對維持血管的正常生理功能起著相當重要的作用。TXA2升高，激活了血小板，使血小板聚集增強，血液黏度增高，血流緩慢，形成微血栓。血小板活性的增強還可增加血管壁的通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲出，滲出的蛋白質(zhì)成分沉積在血管基底膜，又可使基底膜增生，從而導(dǎo)致蛋白尿和滲出性視網(wǎng)膜病變。此外，TXB2合成增加進一步刺激了ET的表達和合成，加重了血管內(nèi)皮細胞的損傷，促進血管平滑肌細胞增生，導(dǎo)致血管狹窄，促進血管病變的發(fā)生發(fā)展〔10，11〕。目前常測定其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α反映TXA2和PGI2的濃度。

本實驗結(jié)果顯示:本模型大鼠血清中NO與NOS下降不明顯，但生地-山茱萸藥對可維持NO/ET和TXB2和PGI2穩(wěn)態(tài)平衡，可能與調(diào)節(jié)血管舒縮、抑制血小板聚集、降低外周血管阻力及調(diào)節(jié)血流量分布等多種途徑有關(guān)。同時，SOD活力增加，表明清除自由基能力增強，與兩組動態(tài)平衡起協(xié)同作用，共同達到保護血管目的。

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