珙桐內(nèi)生真菌Lophiostoma sp.（X1－2）石油醚部位化學成分研究

張 亮 劉艷輝 羅 薇 郭志勇 鄧張雙 鄒 坤

（三峽大學 化學與生命科學學院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

近年來，植物內(nèi)生菌已經(jīng)成為活性天然產(chǎn)物最重要的新來源，是藥物的先導化合物的重要來源之一.在植物內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物的研究中，從微生物種類來看，主要集中在真菌的代謝產(chǎn)物研究上；從代謝產(chǎn)物類型上看，主要集中在聚酮，萜類，生物堿等類型代謝產(chǎn)物上［1].在上述研究過程中，忽視了對低極性成分的研究，特別是石油醚部位的化學成分的研究，但從目前的研究現(xiàn)狀來看，不斷有新的具有特殊功能的低極性脂肪酸被發(fā)現(xiàn)［2－3]，而且脂肪酸在生命過程中扮演著非常重要的角色，如降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，增強細胞活力，增強記憶力和思維能力，促進脂溶性維生素的消化和吸收等生理功能等［4]，因而在該文中，通過GC－MS方法分析來自我國特有的瀕危植物珙桐內(nèi)生真菌Lophiostomasp.（X1－2）的石油醚部位的化學成分，為內(nèi)生真菌低極性部位的合理利用提供理論和應用依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與實驗儀器

X－4數(shù)字顯示顯微熔點儀（溫度未校正），北京泰克儀器有限公司；AL204型電子天平（Mettlwr Tol EDO）；N21001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司），GC－MS（美國Finnigan公司，TRACE GC－MS）；柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其它試劑均為分析純.

1.2 菌種

Lophiostomasp.（X1－2）菌株是采自湖北省宜昌市大老嶺國家森林公園中珙桐莖皮，經(jīng)平板劃線分離純化，該菌種保存在三峽大學化學與生命科學學院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室內(nèi)，保存在4℃的PDA固體培養(yǎng)基中，經(jīng)分子生物學鑒定菌株X1－2為Lophiostomasp..

1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

采用固態(tài)培養(yǎng)方式，發(fā)酵培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基，大米80g，水160mL，裝入500mL三角瓶內(nèi)，經(jīng)121℃，0.1MPa，高溫滅菌25min后，在超凈工作臺上接種，共接種40瓶，28℃靜置培養(yǎng)40d.

1.4 提取分離

將大米培養(yǎng)基發(fā)酵物，用乙酸乙酯萃取至無色，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至干，得到濃縮物120g，將濃縮物溶解拌硅膠過柱，以石油醚－丙酮－甲醇梯度洗脫，收集各組分.石油醚洗脫部分為石油醚部位.

1.5 甲酯衍生化［5]

稱取經(jīng)石油醚洗脫得到的樣品50mg置50mL圓底燒瓶中，加φ（H2SO4）＝1%的甲醇溶液2mL，于70℃水浴加熱反應30min，反應完畢后，于反應液中加2mL正己烷，再加蒸餾水，充分振蕩，靜置分層后取上清液.用1mL正己烷洗滌上清液，將洗滌后的上清液以CaCl2干燥后，取上清液待測.

1.6 GC－MS［6]

毛細管柱DB－WAS：30m×0.25mm×0.25μm；進樣口溫度280℃；載氣：高純氮氣；載氣流量1.5 mL／min（氣相色譜柱頭壓為1.0×105Pa），進樣量：1 μL.升溫程序：柱初始溫度150℃，保溫5min；終止溫度300℃，保溫3min；升溫速率6℃／min；采用TIC監(jiān)測方式，質(zhì)譜掃描范圍：29～449amu（如圖1所示）.

圖1 內(nèi)生真菌Lophiostoma sp.（X1－2）石油醚部位甲酯化GC－MS圖譜

2 結(jié)果與討論

從表1顯示的結(jié)果表明，珙桐內(nèi)生真菌Lophiostomasp.（X1－2）的石油醚部位的主要化學成分為達瑪烷型三萜和脂肪酸，其中達瑪烷型三萜類成分占其總成分的43.95%，接近于一半，而各種脂肪酸的含量約為54.54%，其它的微量成分只占總量的2%左右.其中脂肪酸以9（E）烯－十八碳酸甲酯，十八碳酸甲酯，9（Z），13（Z）二烯－十八碳酸甲酯，10（Z）烯－十九碳酸甲酯，二十四碳酸甲酯5種脂肪酸為主，其含量分別達13.61%，19.02%，11.61%，3.53%，1.42%，在脂肪酸中不飽和脂肪酸含量為28.75%，占總脂肪酸的一半還多，表明該真菌能夠合成種類繁多的不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸僅占20.44%.

表1 石油醚部位甲酯化衍生GC－MS結(jié)果

續(xù)表1 石油醚部位甲酯化衍生GC－MS結(jié)果

與其它微生物產(chǎn)生的脂肪酸的結(jié)構(gòu)類型比較發(fā)現(xiàn)，一般微生物中以十六碳酸和十八碳酸及其相應的不飽和脂肪酸為主，而珙桐內(nèi)生真菌Lophiostoma sp.（X1－2）卻以十八碳酸和十九碳酸及其大于十九個碳的脂肪酸為主，表明真菌Lophiostomasp.（X1－2）在其脂肪酸的生源合成過程，有更多2C單元的乙酰輔酶參與脂肪酸的合成.從生物燃料的利用角度來看，更長的碳鏈就意味著在相同條件下能釋放更多的能量.同時另外一個主要的成分達瑪烷型甾烷，在乙酸乙酯部位化學成分分離中，得到證實，其中在乙酸乙酯部分化學成分中的主要成分之一是3－氫松苓酸B，從其結(jié)構(gòu)來看，應該是GC－MS檢測出的化合物1的在內(nèi)生真菌Lophiostomasp.（X1－2）中氧化的產(chǎn)物［7].從上述GC－MS結(jié)果可推測，珙桐內(nèi)生真菌Lophiostomasp.（X1－2）的酶系中主要以聚酮和萜類化合物的合成酶為主，因為在乙酸乙酯部位化學成分的分離中發(fā)現(xiàn)，該真菌的主要次級代謝額產(chǎn)物類型主要是萜類和脂肪酸衍生物為主（如圖2～3所示）.

圖3 內(nèi)生Lophiostoma sp.（X1－2）石油醚部位脂肪酸成分結(jié)構(gòu)

隨著各種不同脂肪酸的生物功能被闡明，而該內(nèi)生真菌含有豐富的脂肪酸成分，值得進一步深入研究，為其開發(fā)利用不飽和脂肪酸及其提供理論依據(jù).

（致謝：感謝三峽大學化學與生命科學學院實驗中心潘家榮老師GC－MS測試工作.）

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