蛋白酶體功能障礙通過(guò)激活P53抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖*

劉雪芹， 宋慧芳， 陸 利

(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西 太原 030001)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)是存在于骨髓中的成體干細(xì)胞，因具有易獲得、低免疫原性等特點(diǎn)成為醫(yī)學(xué)組織工程理想的種子細(xì)胞[1－2]。然而，與體細(xì)胞相似hBMSCs也存在復(fù)制性衰老，因而限制了hBMSCs的臨床應(yīng)用。我們近期研究[3]顯示蛋白酶體功能障礙與hBMSCs老化進(jìn)程密切相關(guān)，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs細(xì)胞增殖能力下降，出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，其潛在的調(diào)控機(jī)制亟待闡明。p53屬于抑癌基因家族，位于染色體17p13.1，全長(zhǎng)16～20 kb，編碼分子量為53 kD的核內(nèi)磷酸化蛋白。P53具有轉(zhuǎn)錄因子作用，在調(diào)控凋亡、發(fā)育、分化以及DNA修復(fù)等過(guò)程中扮演重要角色。有報(bào)道證實(shí)[4－5]，P53作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞衰老進(jìn)程發(fā)揮重要作用，抑制P53激活能夠延緩成纖維細(xì)胞老化。那么，蛋白酶體功能障礙是否可能通過(guò)激活P53，進(jìn)而導(dǎo)致晚期hBMSCs細(xì)胞增殖能力降低?為驗(yàn)證這一推測(cè)，我們進(jìn)行了以下研究。

材料和方法

1 體外培養(yǎng)hBMSCs

hBMSCs購(gòu)自 ScienCell Research Laboratory，含10%胎牛血清(HyClone)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。依據(jù)體外傳代次數(shù)將hBMSCs分為早期組(第3～4代)與晚期組(≥14代)。

2 干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組

早期hBMSCs依據(jù)干預(yù)條件不同分為:(1)DMSO(二甲基亞砜)對(duì)照組;(2)MG132組:10 μmol/L蛋白酶體抑制劑MG132作用4 h;(3)P53抑制劑pifithrin－α(PFT－α)+MG132組:20 μmol/L P53抑制劑PFT－α作用1 h隨后加入終濃度為10 μmol/L MG132作用4 h。

晚期hBMSCs分為:(1)DMSO對(duì)照組;(2)PFT－α 組:20 μmol/L PFT －α 作用48 h。

3 蛋白酶體活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

收集早、晚期hBMSCs，用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，依照蛋白酶體活性分析試劑盒(Millipore)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，熒光酶標(biāo)儀(Bio－Rad)檢測(cè)分析。

4 Western blotting

收集早、晚期hBMSCs，用RIPA buffer提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20μg總蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜，5%脫脂奶粉液封閉后加入Ⅰ抗:兔抗P53(1∶400，Santa Cruz)，兔抗 β －actin(1∶2000，康為世紀(jì)生物科技有限公司)4℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗兔Ⅱ抗室溫雜交2 h(1∶5000，中杉金橋)，按照化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(GE Healthcare Life Science)說(shuō)明書(shū)曝光顯影于膠片。

5 BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hBMSCs增殖能力

含 BrdU(終濃度 10 μmol/L)10%FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h，4%多聚甲醛室溫20 min固定細(xì)胞，加入2 mol/L HCl 37℃水浴10 min使DNA變性，鼠抗 BrdU(1∶100，Abtech Biotechnology)4 ℃孵育過(guò)夜，山羊抗鼠Cy3(1∶100，Invitrogen)37℃孵育2 h，DAP封片液封片，Olympus熒光顯微鏡計(jì)數(shù)、拍片。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集細(xì)胞，70%冷乙醇4℃固定4 h，1000 r/min室溫離心5 min棄上清，PBS重懸細(xì)胞團(tuán)，300目網(wǎng)過(guò)濾，加入50 mg/L碘化丙啶(PI)染液，室溫避光20 min后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間的比較采用Oneway ANOVA方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 早、晚期hBMSCs蛋白酶體活性及P53表達(dá)變化

傳代晚期hBMSCs蛋白酶體活性較早期細(xì)胞降低31.06% ±3.67%(P ＜0.01)，見(jiàn)圖 1A。Western blotting結(jié)果顯示，晚期hBMSCs P53表達(dá)水平為早期細(xì)胞的 1.2倍(P ＜0.05)，見(jiàn)圖 1B、C，提示晚期hBMSCs伴隨蛋白酶體活性降低，P53表達(dá)上調(diào)、活性增強(qiáng)。

2 阻斷P53對(duì)蛋白酶體功能障礙hBMSCs增殖能力的影響

BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MG132組BrdU陽(yáng)性率(33.36% ±2.24%)較 DMSO 對(duì)照組(72.80% ±7.46%)顯著降低(P＜0.01)，提示抑制蛋白酶體活性可抑制hBMSCs增殖潛能。PFT－α +MG132組BrdU陽(yáng)性率(49.23% ±2.67%)顯著高于MG132組(33.36% ±2.24%;P ＜0.05)，提示阻斷 P53 活化能夠削弱蛋白酶體功能障礙對(duì)hBMSCs增殖能力的影響，見(jiàn)圖2。

Figure1.The decreased proteasomal activity(A)and elevated P53 expression(B)in late－passage hBMSCs..n=4.*P＜0.05 vs early.圖1 晚期hBMSCs蛋白酶體活性和P53的表達(dá)

Figure2.The influence of inhibition of P53 on proliferation of hBMSCs with proteasome dysfunction assayed by BrdU incorporation.BrdU－positive cells were shown in red and nuclei were counterstained with DAPI(blue).Scale bar=100 μm..n=15.＊＊P ＜0.01 vs DMSO control group;#P ＜0.05 vs MG132 group.圖2 BrdU摻入法檢測(cè)阻斷P53對(duì)蛋白酶體功能障礙hBMSCs增殖的影響

3 阻斷P53對(duì)蛋白酶體功能障礙hBMSCs細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，MG132組G1期細(xì)胞較DMSO對(duì)照組顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞減少，增殖指數(shù)顯著低于DMSO組(P＜0.01)。PFT－α+MG132組各期細(xì)胞分布與DMSO對(duì)照組相似，增殖指數(shù)顯著高于MG132組(P＜0.05)。結(jié)果提示蛋白酶體活性下調(diào)可使hBMSCs阻滯于G1期，抑制P53激活則能夠促使細(xì)胞越過(guò)G1/S轉(zhuǎn)換點(diǎn)，進(jìn)而恢復(fù)hBMSCs增殖能力，見(jiàn)表1。

4 P53抑制劑對(duì)晚期hBMSCs增殖能力的影響

BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PFT－α組BrdU陽(yáng)性率34.42% ±8.35%顯著高于DMSO對(duì)照組9.68%±5.23%(P ＜0.01)，提示抑制 P53 活性有助于維持晚期hBMSCs增殖潛能，見(jiàn)圖3。

表1 流F式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hBMSCs細(xì)胞周期分布Table1.Cell cycle distribution of hBMSCs measured by flow cytometry(%..n=4)

表1 流F式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hBMSCs細(xì)胞周期分布Table1.Cell cycle distribution of hBMSCs measured by flow cytometry(%..n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DMSO control group;#P ＜0.05 vs MG132 group.

Group G1 S G2/M PI DMSO 90.80±0.22 5.57±0.20 3.46±0.42 9.20±0.21 MG132 93.38±0.07＊＊ 3.33±0.14* 3.29±0.07 6.62±0.07＊＊PFT－α +MG13291.11±0.54# 4.19±0.57 4.71±0.04# 8.90±0.53#

Figure3.The effect of PFT－α on late－passage hBMSCs assayed by BrdU incorporation.BrdU －positive cells were shown in red and nuclei were counterstained with DAPI(blue).Scale bar=100 μm..n=15.＊＊P＜0.01 vs DMSO control group.圖3 BrdU摻入法檢測(cè)PFT－α對(duì)晚期hBMSCs增殖的影響

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。hBMSCs不僅能夠向多種組織和細(xì)胞分化，而且易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，遺傳背景穩(wěn)定，已經(jīng)成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療等方面的研究熱點(diǎn)。然而，組織工程需要高濃度細(xì)胞進(jìn)行移植接種，源自體內(nèi)的hBMSCs存在數(shù)量上的局限性，需經(jīng)體外擴(kuò)增后用于移植治療。新近的研究與我們的報(bào)道證實(shí)[6－7]，伴隨傳代次數(shù)增多 hBMSCs出現(xiàn)老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為胞體變大、胞漿內(nèi)顆粒物聚集，細(xì)胞增殖和分化潛能下降，hBMSCs的老化現(xiàn)象直接限制了其臨床應(yīng)用。

蛋白酶體是體內(nèi)除溶酶體之外的另一重要蛋白水解體系，它通過(guò)降解泛素化的底物蛋白參與維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。我們的前期研究結(jié)果表明[3]，蛋白酶體與hBMSCs功能的維持密切相關(guān)，抑制蛋白酶體活性能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs出現(xiàn)早衰表型;相反，若激活蛋白酶體活性則能維持hBMSCs增殖潛能和分化潛能。本研究結(jié)果也證實(shí)晚期hBMSCs蛋白酶體活性較早期細(xì)胞降低31.06% ±3.67%，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132能夠誘導(dǎo)早期hBMSCs細(xì)胞出現(xiàn)衰老細(xì)胞的特征，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少，細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G1期，進(jìn)一步表明蛋白酶體是維持hBMSCs細(xì)胞活力的重要因素。Arslan 等[8]和 Chondrogianni等[9]研究也證明，抑制蛋白酶體活性能夠使細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白和氧化蛋白堆積，造成細(xì)胞周期停滯，增殖能力降低，細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激的能力下降。

P53是一種短半衰期轉(zhuǎn)錄因子，其穩(wěn)定性主要由泛素－蛋白酶體水解途徑調(diào)節(jié)，P53在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、衰老、分化等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示晚期hBMSCs伴隨蛋白酶體活性降低，P53表達(dá)水平增高，提示P53激活可能是蛋白酶體功能障礙導(dǎo)致晚期hBMSCs增殖能力降低的重要下游事件。應(yīng)用P53抑制劑PFT－α能夠削弱蛋白酶體功能障礙對(duì)hBMSCs增殖能力的影響，PFT－α +MG132組 BrdU陽(yáng)性率(49.23% ±2.67%)顯著高于 MG132 組(33.36% ±2.24%)。此外，PFT－α +MG132組細(xì)胞周期分布與DMSO對(duì)照組相似，G1期細(xì)胞較MG132組減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多，提示抑制P53激活能夠促使細(xì)胞越過(guò)G1/S轉(zhuǎn)換點(diǎn)，進(jìn)而恢復(fù)hBMSCs增殖能力。Liu等[11]應(yīng)用p53－shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染hBMSCs，他們發(fā)現(xiàn)沉默p53基因能夠推遲hBMSCs衰老進(jìn)程，p53－shRNA組細(xì)胞于第21代出現(xiàn)胞體增大、衰老標(biāo)志物β－Gal活性上調(diào)、細(xì)胞增殖能力下降等老化征象，但是單純抑制p53基因并不能使hBMSCs永生化逃離老化命運(yùn)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)P53抑制劑介導(dǎo)的保護(hù)作用僅限于蛋白酶體功能障礙的晚期hBMSCs，抑制P53激活并不能影響早期hBMSCs的增殖能力，說(shuō)明晚期細(xì)胞增殖活力下降可能是由于蛋白酶體活性下調(diào)，造成P53積聚、激活等綜合作用的結(jié)果。今后仍需在蛋白質(zhì)、基因水平深入研究泛素－蛋白酶體通路及其下游事件在hBMSCs增殖過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，建立高效、科學(xué)的擴(kuò)增方式，推動(dòng)hBMSCs在組織工程學(xué)中的應(yīng)用。

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