骨髓間充質(zhì)干細胞移植對老年癡呆大鼠的防治作用

王思淼 劉麗萍 王曉斐 陳玉丙 (吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春 300)

老年性癡呆(senile dementia)是廣泛性大腦皮質(zhì)萎縮引起的以功能減退和行為、性格障礙為主的老年期常見病，發(fā)病率隨著年齡的增高而增加〔1〕。目前，我國老年癡呆患病人數(shù)在600萬人左右，預(yù)計2030年將增至1 200萬人〔2〕，已成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一。提高老年人的生存質(zhì)量，預(yù)防、治療和減少老年癡呆的發(fā)生已成為當(dāng)今世界研究的重點。

1 材料與方法

1.1 試劑及動物 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶、β－淀粉樣蛋白多肽(Sigma公司)，PCR試劑盒、RNA提取試劑盒(Takara公司)，ELISA試劑盒(上海西唐公司)。清潔級健康Wistar乳鼠，體重 (12±2)g。清潔級健康 Wistar大鼠，體重(350±20)g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)培養(yǎng) 無菌取出Wistar乳鼠股骨，注射器吸取培養(yǎng)基沖出骨髓，200目濾網(wǎng)過濾，制備成單細胞懸液，調(diào)細胞濃度1×105/ml，接種到培養(yǎng)瓶中，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。待細胞長至80%時，胰蛋白酶消化進行傳代，細胞傳至3代時備用。

1.3 動物模型制備 Wistar大鼠麻醉，剪去顱頂部毛，腦立體定位儀固定頭部，常規(guī)消毒皮膚，在顱頂中線縱向開口，暴露顱骨。腦立體定位，前囟后3.0 mm，分別向中線左右各旁開2.2 mm，鉆開顱骨，垂直進針 2.8 mm，將 1 μl的 Aβ1－40(造模前用無菌生理鹽水將 Aβ1－40稀釋成 10 μg/μl，37℃ 下孵育 1 w，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ)緩慢注入海馬區(qū)，留針5 min后緩慢撤針。清潔顱骨，縫合皮膚。

1.4 RT－PCR方法檢測腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的表達BMSCs移植組在制備模型前第1天回輸靜脈BMSCs，BMSCs濃度為1×106/ml，每只鼠回輸1 ml。PBS輸入組回輸PBS，模型組、PBS輸入組與 BMSCs移植組分別注射 Aβ1－40，對照組正常飼養(yǎng)。制備模型8 w后取海馬組織，RT－PCR方法檢測BDNF基因的表達。使用RNA提取試劑盒提取總RNA，BDNF引物序列:上游 5′GTGACAGTATTAGCGAGTGGG3′，下游 5′TATCCTTATGAACCGCCAGCC3′，片段大小為278 bp。GAPDH引物序列:上游 5′ACCACAGTCC ATGCCATCAC3′，下游 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，片段大小為 462 bp;RT－PCR 反應(yīng)后行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 ELISA檢測神經(jīng)生長因子(NGF)的含量 取各組大鼠海馬組織，組織勻漿離心后，ELISA試劑盒檢測NGF的表達，按說明書進行操作，酶標儀在450 nm處檢測吸光值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng) 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的BMSCs，形態(tài)呈長梭形。顯微鏡下觀察，接種后3 d可見少量細胞貼壁，軸突伸出;5 d呈多邊形或梭狀，7 d可見集落形成。經(jīng)3次傳代后，細胞呈單一的長梭形生長，排列呈束狀。見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察BMSCs

圖2 RT-PCR方法檢測BDNF的表達

2.2 RT－PCR方法檢測BDNF的表達 BMSCs移植組的BDNF表達明顯高于模型組及PBS輸入組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。BMSCs移植組的BDNF表達接近于正常對照組(P＞0.05)。模型組的 BDNF表達低于正常對照組(P＜0.05)。見圖2。

2.3 ELISA檢測NGF的含量 BMSCs移植組的NGF表達(71.50±6.18)明顯高于模型組(48.16±9.28)及PBS輸入組(47.16±7.35)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);BMSCs移植組的NGF表達雖高于正常對照組(64.33±4.50)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示BMSCs移植老年癡呆模型大鼠可使NGF的表達量增加。

3 討論

老年癡呆的病因和發(fā)病機制迄今尚不明確。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族主要成員之一，對神經(jīng)元的生長發(fā)育、分化和損傷修復(fù)成熟起著至關(guān)重要的作用〔3〕。BDNF能促進突觸的可塑性，包括增加突觸終末的密度，促進樹突和軸突的長出〔4～6〕。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一，是一種具有神經(jīng)元營養(yǎng)活性的因子，對中樞與周圍神經(jīng)的損傷有保護和恢復(fù)的作用〔7〕。

BMSCs是一種具有自我復(fù)制能力和多分化潛能的細胞，能夠在體外不同的培養(yǎng)條件下分化成不同亞型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞〔8〕。BMSCs在體內(nèi)也可分化為神經(jīng)細胞〔9〕。實驗表明，在移植的BMSCs動物模型中，BDNF、NGF表達量增加，可使神經(jīng)元得到保護并引起神經(jīng)再生效應(yīng)。BMSCs在治療缺血性腦損傷時能在腦中成活并向缺血部位遷移，參與血管組織修復(fù)〔10〕。遷移至病變部位的 BMSCs與損傷宿主神經(jīng)組織間的相互作用，可使BDNF、NGF等因子的表達增加，這些細胞因子對神經(jīng)功能的恢復(fù)發(fā)揮積極的作用。因此，BMSCs移植就成為防治老年癡呆的一個選擇方案，為預(yù)防和減少老年癡呆的發(fā)生帶來新的希望。

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5 Gao X，Smith GM，Chen J.Impaired dendritic development and synaptic formation of postnatal－born dentate gyrus granular neurons in the absence of brain－derived neurotrophic factor signaling〔J〕.Exp Neurol，2009;215:178－90.

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7 徐 清，趙冬梅，黃 飛，等.神經(jīng)生長因子神經(jīng)保護作用的研究進展〔J〕. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007;30(1):43－6.

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9 Brazelton TR，Rossi FM，Keshet GI，et al.From marrow to brain:expression of neuronal phenotypes in adult mice〔J〕.Science，2000;290(5497):1775－9.

10 劉麗萍，那漢榮.骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦缺血模型大鼠記憶功能的影響〔J〕. 中國老年學(xué)雜志，2011;31(15):2910－1.