氨基多糖對RANKL誘導的RAW264.7向破骨細胞樣細胞分化的抑制作用觀察

梁素霞，von den Hoff JW，陳 卓，許慶安

(1天津市口腔醫(yī)院，天津 300041;2荷蘭奈梅亨大學正畸與口腔生物學研究中心;3浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院;4武漢大學)

氨基多糖(GAGs)是由氨基己糖與己糖醛酸組成的二糖單元聚合而成的直鏈高分子化合物。多數(shù)GAGs具有黏性，且分子鏈中的羧基和硫酸基使分子具有強酸性(聚陰離子特性)，因而又被稱為“酸性黏多糖”。GAGs包括肝素(heparin)、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)等，在體內(nèi)常以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，是細胞外基質(zhì)的主要組成成分［1］。多項研究顯示氨基多糖參與調(diào)節(jié)凝血、腫瘤生長、骨代謝等多種生物學過程［2～4］。最近有研究顯示氨基多糖可調(diào)節(jié)破骨細胞分化成熟，但機制尚不清楚。2011年，我們觀察了肝素、HA和CS對RANKL誘導下RAW264.7向破骨細胞樣細胞分化的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑 RAW264.7細胞來源于小鼠巨噬細胞系，由荷蘭奈美津正畸與口腔生物學實驗室提供。α-MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清(FCS)購自英國Gibco，青霉素、鏈霉素購于荷蘭生命技術(shù)公司，RANKL購自德國 Santa Cruz，肝素、CSC、高分子量HA(分子量為25～75 KDa)和TRAP染色試劑盒均購自德國 Sigma，8-well chamber slide購于德國Greiner，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)ELISA試劑盒購自德國R＆D。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及干預 小鼠RAW264.7細胞復蘇，于含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，2 min后換液，去除未貼壁細胞。將8-well chamber slides置于細胞培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h。細胞分別接種于8-well chamber slide，每孔200 μL細胞懸液，細胞濃度為40 000/孔。將細胞分為四組:對照組培養(yǎng)液中加入RANKL 90 ng/mL，肝素組加入肝素，HA組加入HA，CSC組加入CSC，濃度梯度分別為肝素:2、10、50、100 μg/mL，HA:0.1、0.5、2.5、5 μg/mL，CSC:2、10、50、100 μg/mL。每個濃度梯度做4個復孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，第2、4、6 天各換液1 次，每次每孔換液100 μL。

1.2.2 觀察項目 ①細胞分化情況:分別取第3、5、7、8天的培養(yǎng)板進行細胞固定。PBS漂洗，2%多聚甲醛固定細胞30 min;pH9.0、濃度為0.2 M 的TRIS緩沖液37℃孵育60 min。TRAP染色試劑用孔徑0.2 μm 的濾膜過濾，孵育染色 5 ～10 min，蒸餾水漂洗;蘇木素復染，封片。TRAP染色陽性細胞的胞質(zhì)呈粉紅色、細胞核數(shù)目≥3個認為是成熟的破骨細胞樣細胞，顯微鏡下行細胞計數(shù)。②TRAP5b含量:收集第8天各組細胞培養(yǎng)液，采用ELISA法測定TRAP5b含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞分化情況 各組均在第2～3天開始出現(xiàn)細胞核數(shù)目≥3個的融合破骨細胞樣細胞。細胞體積在不同培養(yǎng)天數(shù)有所不同:初期體積較小，后逐漸增大，到第7～8天出現(xiàn)巨大破骨細胞樣細胞。細胞形態(tài)呈多樣性，如橢圓形、星形、三角形，可見偽足樣突觸。細胞質(zhì)為TRAP染色陽性，呈粉紅色。第7、8天的成熟破骨細胞樣細胞的胞質(zhì)中空泡多見。破骨細胞樣細胞計數(shù)見圖1、圖2、圖3。分析圖1～3發(fā)現(xiàn)，肝素的抑制作用隨濃度增大而增強，具有劑量依賴性。

2.2 TRAP5b含量 見表1。

3 討論

圖1 肝素組與對照組不同天數(shù)TRAP陽性細胞數(shù)

圖2 HA組與對照組不同天數(shù)TRAP陽性細胞數(shù)

圖3 CSC組與對照組不同天數(shù)TRAP陽性細胞數(shù)

正畸過程中牙槽骨的改建包括牽張側(cè)成骨細胞的成骨過程和壓力側(cè)破骨細胞的骨吸收過程，研究證實這一過程中有RANKL的參與［5］。成骨細胞和破骨細胞之間互相影響，達到相對穩(wěn)態(tài)，此為口腔正畸的生物力學基礎［6］。對成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)尤其是前體細胞向破骨細胞分化和成熟的調(diào)控是近年來的研究熱點。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，氨基多糖作為一種重要的細胞外基質(zhì)成分參與骨吸收過程，對破骨細胞的分化和成熟有誘導作用，但結(jié)果存在分歧。TRAP染色陽性及多核(≥3)特性是破骨細胞分化和成熟的標志。TRAP5b是一種酸性磷酸酶的同功酶，是破骨細胞的標志酶，既能反映破骨細胞的分化、成熟和生物活性，也能反映骨吸收的程度。

表1 各組TRAP5b含量比較(U/L，±s)

表1 各組TRAP5b含量比較(U/L，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與2 μg/mL 組比較，#P ＜0.05;與10 μg/mL 組比較，△P ＜0.05;與50 μg/mL 組比較，▲P ＜0.05

組別 TRAP5b含量肝素組2 μg/mL 28.23 ±0.86*10 μg/mL 21.07 ±0.91*#50 μg/mL 16.96 ±0.77*#△100 μg/mL 15.18 ±0.76*#△▲HA組0.1 μg/mL 14.39 ±0.77*0.5 μg/mL 13.30 ±0.49*2.5 μg/mL 13.24 ±0.88*5.0 μg/mL 12.34 ±0.91*CSC組2 μg/mL 21.69 ±0.60*10 μg/mL 17.19 ±0.44*50 μg/mL 30.60 ±0.50*100 μg/mL 30.46 ±1.30*對照組33.86 ±1.68

Chowdhury等［7］早在1998年研究發(fā)現(xiàn)低濃度(5 μg/mL)肝素活化破骨細胞的活性，促進骨吸收;而 CSA、CSB、CSC 在濃度為 25 μg/mL 和 100 μg/mL時對破骨細胞分化和骨吸收作用都不明顯。與之相悖的是，Ariyoshi等［8］研究發(fā)現(xiàn)肝素可以抑制破骨細胞的分化、成熟和功能;CSB、CSE對小鼠骨髓巨噬細胞向破骨細胞的分化具有抑制作用，但CSB對小鼠RAW264.7細胞向破骨細胞的分化無明顯作用。最近的研究顯示，CSA、CSC在濃度為20、100 μg/mL 時對 RAW264.7 細胞向破骨細胞樣細胞的分化影響不明顯，但CSB、CSD、CSE以及肝素在以上兩種濃度時對破骨細胞樣細胞的分化具有明顯的抑制作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的肝素、CSC干預后破骨細胞樣細胞的分化能力及活性均有所降低。相同培養(yǎng)天數(shù)的肝素組抑制作用隨肝素濃度梯度增大而增強，具有劑量依賴性。Chang等［10］報道，HA通過調(diào)節(jié)Toll樣受體家族成員4(TLR4)的功能抑制骨髓巨噬細胞向破骨細胞樣細胞的分化。Ariyoshi等［11］在2005年發(fā)現(xiàn)低分子量 HA(相對分子質(zhì)量＜8 KDa)與RANKL共同作用可以上調(diào)破骨細胞樣細胞的分化。本研究選取高分子量HA，發(fā)現(xiàn)破骨細胞樣細胞的分化受到抑制，TRAP5b的含量有所減少，提示HA對破骨細胞樣細胞的分化、成熟和骨吸收活性具有抑制作用。

不同的研究出現(xiàn)結(jié)果分歧的原因經(jīng)分析可能與選擇的體外培養(yǎng)模型有關(guān)系，如不同物種、不同細胞來源(巨噬細胞來源的純化培養(yǎng)細胞或者是白血病病毒所致的腫瘤來源的細胞系)會導致結(jié)果出現(xiàn)差異，同時不同種類氨基多糖分子量的區(qū)別和實驗濃度梯度的差異也可能會導致不同結(jié)果的出現(xiàn)。

綜上所述，肝素、HA、CSC三種氨基多糖都對小鼠來源的RAW264.7細胞向破骨細胞樣細胞的分化和成熟具有抑制作用，且肝素的抑制作用具有劑量依賴性，其具體的分子調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。

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