SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)rs5418位點(diǎn)變異對(duì)基因表達(dá)的影響*

夏小慧，胡 揚(yáng)，張騰國，陳 婷

(1蘭州城市學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;2北京體育大學(xué)，北京 100084;3西北師范大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

葡萄糖是機(jī)體生命活動(dòng)中最重要的能源物質(zhì)之一。機(jī)體利用葡萄糖的首要步驟是在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(solute carrier family 2，facilitated glucose transporter，member 4 protein，SLC2A4)是存在于人類骨骼肌中的主要亞型，是骨骼肌吸收和利用葡萄糖的關(guān)鍵限速物質(zhì)［1］。rs5418位點(diǎn)是位于SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)－30 bp處的 G→A變異，在不同人群中分布不同［2］。該位點(diǎn)多態(tài)與能量代謝相關(guān)的表型如糖尿?。?］、肥胖癥［2］等的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。本課題組前期通過對(duì)優(yōu)秀耐力運(yùn)動(dòng)員和普通人該位點(diǎn)多態(tài)性的研究，也發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)與優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的有氧耐力相關(guān)聯(lián)(結(jié)果未發(fā)表)。為進(jìn)一步研究該位點(diǎn)變異是否會(huì)影響下游基因表達(dá)，本文通過分子生物學(xué)方法，檢測rs5418位點(diǎn)攜帶不同等位基因的重組表達(dá)載體啟動(dòng)下游報(bào)告基因的活性，以探討位點(diǎn)變異與能量代謝相關(guān)表型相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

Taq DNA polymerase、dNTP 和 DNA marker DL2000購自Sangon;Kpn I、HindⅢ內(nèi)切酶、PCR膠回收試劑盒購自TaKaRa;瓊脂粉、胰蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XOID;T4 DNA連接酶、pGL3－basic、pGL3－promoter、pRL－TK載體、雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒、快速轉(zhuǎn)染試劑盒和基因組DNA純化試劑盒均購自Promega;In－FusionTMAdvantage PCR Cloning Kit試劑盒購自Clontech;胎牛血清購自HyClone;質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自O(shè)mega;胰蛋白酶購自Difco;RPMI－1640培養(yǎng)基購自Gibco;其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自Novasygen;HEK293T細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 SLC2A4基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增 在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找人類SLC2A4基因序列位于第17號(hào)染色體(RefSeq:NG_012127.1)，基因全長 6314 bp。在http://genome.ucsc.edu網(wǎng)站查找，預(yù)測可能的啟動(dòng)子序列位于chr17:7124278～7125777(refGene_NM_001042_0)。檢索DBTSS數(shù)據(jù)庫(http://dbtss.hgc.jp/)，查找轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，確定SLC2A4基因包括rs5418在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游核心啟動(dòng)子區(qū)，如圖1所示(雙下劃線所示為rs5418多態(tài)位點(diǎn))。用Primer Premier 5.0軟件在SLC2A4基因基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物。參照報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3－basic的多克隆位點(diǎn)，選擇Kpn I和Hind III為克隆的限制性內(nèi)切酶，在上、下游引物的5'端分別引入酶切位點(diǎn)，并加入相應(yīng)的保護(hù)堿基(下劃線處為引入的酶切位點(diǎn)):上游引物5'－TATGGTACCGGGTTACTTTGGGG CATTG －3'，下游引物5'－TGTAAGCTTCTTCGGAGCCTATCTGTTGG－3'。以課題組前期研究中確定的rs5418位點(diǎn)為AA純合子的個(gè)體基因組DNA為模板，64.3℃退火40 s擴(kuò)增得到目的片段，目的片段長度為716 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段大小。

Figure 1.The position of core promoter sequence in SLC2A4 gene(shown in italics and bold).圖1 SLC2A4基因核心啟動(dòng)子序列位置

2.2 pGL3－SLC2A4－prom(A)和pGL3－SLC2A4－prom(G)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Kpn I和Hind III雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pGL3－basic經(jīng)T4 DNA連接酶4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序。重組質(zhì)粒命名為pGL3－SLC2A4－prom(A)。

根據(jù)pGL3－basic載體序列與rs5418位點(diǎn)位置，設(shè)計(jì)2對(duì)突變引物。F01:5'－TTTCTCTATCGATAGGTACCGGGTTAC－3';F02:5'－AAGCCAAGGACCCGGAGAGCAG－3';R01:5'－CCGGAATGCCAAGCTTCTTCGG－3';R02:5'－GCTCTCCGGGTC-CTTGGCTTGTGGCTG－3'。F01/F02引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為533 bp，R01/R02引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為221 bp。引物在序列中的位置見圖2，單下劃線處為引物所處位置，雙下劃線處為突變位點(diǎn)，兩側(cè)序列為載體固有序列。分別用F01/F02引物對(duì)和R01/R02引物對(duì)以pGL3－SLC2A4－prom(A)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。60℃退火45 s擴(kuò)增得到目的片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段。純化所得PCR產(chǎn)物I、PCR產(chǎn)物II。對(duì)表達(dá)載體PGL3－basic線性化，按照In－Fusion Advantage PCR Cloning Kit說明書進(jìn)行融合連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序。重組質(zhì)粒命名為pGL3－SLC2A4－prom(G)。

Figure 2.The position of PCR mutation primers in plasmid vector(ittalic and under lined).圖2 PCR突變引物在質(zhì)粒載體中的位置

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測 以下游帶有螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因的4種質(zhì)粒:pGL3－basic(不帶有任何啟動(dòng)子元件，作陰性對(duì)照)、pGL3－promoter(帶有SV40啟動(dòng)子，作陽性對(duì)照)、pGL3－SLC2A4－prom(G)(帶有含G等位基因的SLC2A4啟動(dòng)子)和pGL3－SLC2A4－prom(A)(帶有含A等位基因的SLC2A4啟動(dòng)子)為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以pRL－TK(帶有HSV TK啟動(dòng)子，下游帶有海腎螢光素酶報(bào)告基因)為共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T。HEK293T細(xì)胞在RPMI－1640培養(yǎng)基中(含 10%FBS)，37 ℃、5%CO2、100%相對(duì)濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程按TransFastTMTransfection Reagent要求進(jìn)行操作。熒光素酶活性按Dual－Luciferase? Reporter Assay System要求用Glo Max 20/20發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測過程重復(fù)3次，每次每種質(zhì)粒平行5個(gè)孔。報(bào)告基因表達(dá)活性(相對(duì)發(fā)光值)=螢火蟲螢光素酶發(fā)光值/海腎螢光素酶發(fā)光值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 SLC2A4基因啟動(dòng)子序列擴(kuò)增

成功擴(kuò)增到大小約為716 bp的片段，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。

Figure 3.Amplification of SLC2A4 gene promoter.M:DNA molecular weight marker DL2000;1:product of PCR amplification.圖3 SLC2A4基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增

2 pGL3－SLC2A4－prom(A)和pGL3－SLC2A4－prom(G)重組質(zhì)粒鑒定及測序

重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。測序結(jié)果顯示，插入載體的重組序列大小為716 bp，與GenBank公布的SLC2A4基因啟動(dòng)子序列相比，有2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變，同源性為99.7%。

Figure 4.Enzyme digestion result of recombinant plasmid.M:DNA molecular weight marker DL2000;1:the products digested by Hind III and Kpn I.圖4 重組質(zhì)粒酶切鑒定

突變引物擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5，結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出包括突變位點(diǎn)在內(nèi)的2段目的片段。PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物II經(jīng)融合反應(yīng)、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆后，獲得了只有rs5418一個(gè)位點(diǎn)差異的重組質(zhì)粒。圖6所示為構(gòu)建的 pGL3－SLC2A4－prom(A)和pGL3－SLC2A4－prom(G)重組質(zhì)粒部分測序圖。

Figure 5.Fragments amplified by mutation primers.M:DNA molecular weight marker DL2000;1:product I;2:product II.圖5 突變引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 6.Sequencing of the recombinant plasmid fragments.The pGL3－SLC2A4－prom(A)and pGL3－SLC2A4－prom(G)had only a single－locus difference.圖6 重組質(zhì)粒部分測序圖

3 不同質(zhì)粒中螢光素酶報(bào)告基因的相對(duì)活性

4種不同質(zhì)粒中報(bào)告基因在HEK293T細(xì)胞中的相對(duì)活性見圖7。單因素方差分析結(jié)果顯示，在HEK293T細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組(pGL3－basic)對(duì)比，pGL3－SLC2A4－prom(A)、pGL3－SLC2A4－prom(G)和pGL3－promoter轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中螢光素酶相對(duì)活性高，差異顯著(P＜0.05)。與pGL3－SLC2A4－prom(G)組相比，pGL3－SLC2A4－prom(A)組螢光素酶相對(duì)活性表達(dá)量高，差異顯著(P＜0.05)。

討 論

Figure 7.The relative luciferase activity of transfected plasmids in HEK293T cells..n=15.△P＜0.05 vs pGL3－basic;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pGL3－SLC2A4－prom(A).圖7 不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中報(bào)告基因在HEK293T細(xì)胞中的相對(duì)活性

rs5418多態(tài)位點(diǎn)位于SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)。真核生物的啟動(dòng)子位置不確定，多分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的200 bp以內(nèi)，傳統(tǒng)的啟動(dòng)子研究方法是從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定開始。本研究結(jié)合與啟動(dòng)子相關(guān)的預(yù)測軟件，預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及啟動(dòng)子基礎(chǔ)核心區(qū)，以此為實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)，指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，同時(shí)也在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果。本研究中，重組載體的報(bào)告基因表達(dá)活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性對(duì)照載體，插入的序列成功啟動(dòng)了下游報(bào)告基因的表達(dá)，表明預(yù)測的啟動(dòng)子序列正確，并在本研究中成功克隆到SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。

由于SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)除了rs5418位點(diǎn)外還有另外4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)［5］，為了排除其它多態(tài)位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)的影響因素，本研究采用了定點(diǎn)突變的方法獲得了只有1個(gè)位點(diǎn)差異的突變重組載體。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，攜帶A等位基因的載體啟動(dòng)下游報(bào)告基因表達(dá)的能力比攜帶G等位基因的載體強(qiáng)。由此推測，該多態(tài)位點(diǎn)是一個(gè)功能性多態(tài)位點(diǎn)，其生物學(xué)活性在于不同等位基因能顯著改變啟動(dòng)子活性，從而影響SLC2A4基因表達(dá)活性。

rs5418多態(tài)位點(diǎn)影響基因表達(dá)活性，可能的原因有以下幾點(diǎn):(1)rs5418位于SLC2A4基因5’UTR區(qū)，該區(qū)域包含控制轉(zhuǎn)錄的功能元素，同時(shí)對(duì)mRNA的翻譯有重要的調(diào)節(jié)作用。翻譯起始時(shí)，核糖體小亞基以及相關(guān)起始因子復(fù)合體，在mRNA帽子位點(diǎn)，掃描5’UTR區(qū)尋找AUG的起始密碼子。5’UTR區(qū)的長度、形成的可能二級(jí)結(jié)構(gòu)、AUG上游的起始序列以及AUG周圍的序列環(huán)境都會(huì)很大程度上影響翻譯的效率［6］。(2)經(jīng) SNP Selector軟件和 EBI(http://www.ebi.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測，該位點(diǎn)位于基因CpG島處，在真核細(xì)胞DNA中，CpG序列中的胞嘧啶殘基通常會(huì)被甲基化，但在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)則很少甲基化。當(dāng)rs5418位點(diǎn)等位基因?yàn)锳時(shí)，CpG島甲基化幾率降低，而轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，當(dāng)?shù)任换驗(yàn)镚時(shí)，CpG島甲基化幾率增加，從而降低轉(zhuǎn)錄活性［5］。(3)調(diào)控SLC2A4基因表達(dá)的兩個(gè)重要調(diào)節(jié)因子GEF(GLUT4 enhancer factor)和MEF－2A(myocyte－specific enhancer factor 2A)結(jié)合于SLC2A4基因啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控基因的表達(dá)［7－8］。該位點(diǎn)的變異也可能影響調(diào)節(jié)因子的作用，從而影響基因表達(dá)。

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