• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病KKAy小鼠腎臟TGF-β1和BMP-7 表達的影響*

    2012-12-23 04:07:30李姝玉柴新樓賈德賢蘇瑋蓮
    中國病理生理雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:葛根素腎小管周齡

    李姝玉, 柴新樓, 吳 瑩, 賈德賢, 郝 鈺, 蘇瑋蓮, 王 謙△

    (1北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,北京100029;2天津醫(yī)科大學,天津300070)

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見而難治的微血管并發(fā)癥,是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。在DN 發(fā)病過程中,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)起著關(guān)鍵的作用,可以促進糖尿病腎小球纖維化和間質(zhì)纖維化過程的發(fā)生、發(fā)展。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性腎臟保護因子,具有抗纖維化的作用,能夠拮抗TGF-β1的作用。黃芪和葛根是治療DN 的常用中藥,能有效改善腎臟功能,然而,其作用機制尚缺乏充分了解。因此,本研究觀察黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病腎病模型KKAy小鼠腎臟TGF-β1和BMP-7 表達的影響,探討黃芪注射液和葛根素注射液治療DN 的有關(guān)作用機制。

    材 料 和 方 法

    1 動物

    SPF 級KKAy小鼠40 只,雄性,9 ~11 周齡,25 ~28 g,購自中國醫(yī)學科學院動物中心,許可證號為SCXK(京)2005-0013,隨機血糖≥13.9mol/L,確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J 小鼠18 只,雄性,9 ~11周齡,23 ~25 g,許可證號為SCXK(京)2003-0003,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗期間,動物自由飲水,KKAy小鼠給予高脂飼料(中國醫(yī)學科學院動物中心提供),C57BL/6J 小鼠給予生長維持顆粒飼料(購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司),以上動物均飼養(yǎng)在中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)。

    2 藥物與試劑

    黃芪注射液購自成都地奧九泓制藥廠,規(guī)格為每毫升含生藥2 g,產(chǎn)品批號為0608056。葛根素注射液購自浙江康恩貝制藥股份有限公司,規(guī)格為每毫升含葛根素50 mg,產(chǎn)品批號為0601013。TGF-β1兔抗多克隆抗體和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及高敏過氧化物復合酶購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol 購自Invitrogen,RT-PCR有關(guān)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,TGF-β1上游引物序列5'-TCCCTCAACCTCAAATTATTCA-3',下游引物序列5'-GCGGTCCACCATTAGCAC-3',擴增后片段長度為493 bp;BMP-7 上游引物序列5'-GACGCCAAAGAACCACAAGAG-3',下游引物序列5'-TCACAGTAGTAGGCAGCATAGC-3',擴增后片段長度為165 bp;β-actin 上游引物序列5'-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3',下游引物序列5'-CACGTCACACTTCATGATGGAG-3',擴增后片段長度為243 bp。

    3 主要儀器

    Freestyle 利舒坦血糖儀,日立7600P 全自動生化分析儀,Eppendorf RT-PCR 儀,紫外分光光度計,凝膠成像儀。

    4 方法

    4.1 動物分組及給藥方法 KKAy小鼠飼養(yǎng)至14周齡時,將其按照隨機血糖分組:模型組(model group,MG)20 只;治療組(treatment group,TRG)20只,每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL·kg-1·d-1)和葛根素注射液(1.3 mL·kg-1·d-1),2 種藥物先后給藥。18 只C57BL/6J 小鼠作為正常組(normal group,NG)。實驗期間,各組動物自由飲食、飲水。分別于20 周齡、24 周齡和28 周齡處死動物。

    4.2 小鼠一般狀態(tài)及體重變化 每天觀察小鼠一般狀態(tài),隔周稱量各組小鼠體重。

    4.3 血清生化指標檢測 剪尾檢測20 周齡、24 周齡和28 周齡各組小鼠空腹血糖(blood glucose,BG)。20 周齡小鼠禁食12 ~14 h 后,處死動物,眼球取血,分離血清,日本日立7600P 全自動生化分析儀測定血清甘油三酯(triglyceride,TG)、膽固醇(cholesterol,TC)及血肌酐(serum creatinine,SCr)。24 周齡和28 周齡小鼠指標檢測方法同上。

    4.4 免疫組織化學染色 將石蠟包埋的腎組織制成4 μm 厚的切片,用SABC 法檢測腎組織TGF-β1的蛋白表達情況。以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。每張切片隨機選取6 個高倍視野,每組選取6 張切片,Olympus 公司圖像采集系統(tǒng)采集圖像,Image-Pro Plus 5.1 圖像分析軟件進行半定量分析。

    4.5 RT-PCR 檢測腎組織TGF-β1和BMP-7 mRNA 表達 按照Trizol 說明書提取腎組織總RNA,紫外分光光度計測定總RNA 質(zhì)量與濃度。每組分別取5 μg 先進行逆轉(zhuǎn)錄反應,反應結(jié)束后分別取4 μL 反應產(chǎn)物,進行多聚酶鏈(PCR)反應,TGFβ1、BMP-7 和β-actin 的退火溫度均為50 ℃,95℃5 min,95 ℃30 s,50 ℃30 s,72 ℃40 s,擴增36輪。PCR 產(chǎn)物的電泳分析:取10 μL 產(chǎn)物,進行2%瓊脂糖凝膠電泳,電泳后于紫外燈下根據(jù)PCR marker 位置判斷目標產(chǎn)物,拍照后進行灰度掃描,分別計算TGF-β1和BMP-7 擴增產(chǎn)物的吸光度值與β-actin 擴增產(chǎn)物的吸光度值的比值作為表達水平參數(shù),進行半定量分析。

    5 統(tǒng)計學處理

    結(jié) 果

    1 一般狀態(tài)及體重變化情況

    模型組小鼠有精神不振,活動遲緩,尿量明顯增多,體毛缺乏光澤,而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。模型組28 周齡小鼠有1 只死亡。模型組小鼠各時點體重均比正常組增長明顯,差異顯著(P <0.01)。治療組小鼠20、24 周齡體重均比正常組增長明顯,差異顯著(P<0.01);與模型組相比,治療組20 ~28 周小鼠體重增長減緩,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05 或P <0.01),見表1。

    表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

    表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

    **P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG. NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.

    Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 25.68 ±4.49(n=6) 30.17 ±1.94(n=6) 32.83 ±3.66 (n=6)MG 41.42 ±2.53**(n=6) 45.13 ±2.09**(n=6) 43.28 ±3.65**(n=7)TRG 36.47 ±3.23**▲(n=6) 39.93 ±3.31**▲▲(n=6) 35.87 ±4.91▲▲(n=8)

    2 血清生化指標檢測結(jié)果

    從20 周齡開始,模型組及治療組小鼠血糖比正常組高,差異顯著(P <0.01),治療組小鼠空腹血糖較模型組降低,差異顯著(P <0.05 或P <0.01),見表2。模型組SCr 自24 周齡開始明顯升高,與正常組相比差異顯著(P <0.01);治療組小鼠24 及28 周齡時SCr 水平較模型組明顯降低(P <0.01),并且28 周齡時高于正常組(P <0.05),見表2。模型組自20 周齡開始,TG 和TC 明顯升高,與正常組小鼠相比差異顯著(P <0.01);20 和28 周齡時治療組小鼠TG 較模型組有所降低,24 周齡時,治療組小鼠TC 較模型組明顯降低(P <0.01),見表3。

    表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

    表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

    * P <0.05,**P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG.

    Group BG(mmol/L)SCr(μmol/L)20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 5.21±0.95 (n=6) 4.25±1.28(n=6) 3.54±1.06(n=6) 10.05±1.13(n=6) 6.21±2.00(n=6) 9.42±2.60(n=6)MG 22.50±2.69**(n=6) 20.85±5.86**(n= 6) 12.54±2.36**(n=7) 9.45±1.41(n=6) 12.08±1.14**(n=6) 19.17±3.38**(n=7)TRG 13.68±3.15**▲▲(n= 6)14.83±3.21**▲(n=6) 7.00±1.51**▲▲(n=8) 10.10±1.12(n=6) 7.70±0.90▲▲(n=6) 13.36±3.07*▲▲(n=8)

    表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

    表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

    **P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG.

    Group TG TC 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 0.15±0.03(n=6) 0.64±0.06(n=6) 0.65±0.24 (n=6) 2.53±0.23(n=6) 2.04±0.24(n=6) 2.10±0.34(n=6)MG 0.25±0.02**(n=6) 2.20±0.44**(n=6) 1.68±0.60**(n=7) 5.21±1.17**(n=6) 6.48±0.50**(n=6) 6.18±1.73**(n=7)TRG 0.19±0.05▲▲(n=6) 1.79±0.48**(n=6) 1.13±0.48▲(n=8) 5.13±0.85(n=6) 3.86±1.00**▲▲(n=6) 5.43±0.90**(n=8)

    3 免疫組化染色結(jié)果

    正常組腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞胞漿中均有較弱的TGF-β1表達,見圖1A;模型組與正常組比較,腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1強陽性表達,腎小球內(nèi)也可見表達,但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯,且其表達隨周齡增長而增多,見圖1B。治療組小鼠TGF-β1在腎小球和腎小管的表達均較模型組明顯降低,差異顯著(P <0.01),見圖1C、表4。

    4 RT-PCR 檢測TGF-β1和BMP-7 mRNA 的表達

    各周齡模型組小鼠腎臟TGF-β1mRNA 表達均比正常組小鼠高,治療組小鼠TGF-β1mRNA 表達比模型組低,差異顯著(P <0.05);各周齡模型組小鼠腎臟BMP-7 mRNA 表達均比正常組小鼠低,20和24 周齡治療組小鼠BMP-7 mRNA 表達比模型組高,差異顯著(P <0.05),28 周齡治療組與模型組無顯著差異,見圖2、表5。

    Figure 1. Expression of TGF-β1 in renal tissues from each group at the end of 24 weeks (immunohistochemical staining, × 400). A:normal group;B:model group;C:treatment group.圖1 24 周齡各組小鼠腎組織TGF-β1 免疫組化染色

    表4 各組小鼠腎臟TGF-β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF-β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

    表4 各組小鼠腎臟TGF-β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF-β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

    **P <0.01 vs NG;▲▲P <0.01 vs MG.

    Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 20 475.72 ±5 204.95 21 363.45 ±5 111.88 22 598.90 ±5 381.02 MG 94 385.10 ±16 695.46** 142 483.97 ±7 149.30** 192 384.28 ±6 480.86**TRG 28 405.74 ±11 981.22▲▲ 70 242.29 ±7 839.27**▲▲ 63 171.88 ±5 075.73**▲▲

    Figure 2. TGF-β1 and BMP-7 mRNA expression in renal tissues from each group at the end of 24 weeks. M:marker;NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.圖2 24 周齡各組小鼠腎組織TGF-β1 和BMP-7 mRNA 表達情況

    表5 各組小鼠腎臟BMP-7 和TGF-β1 的RT-PCR 圖像分析結(jié)果Table 5. Image analysis results examined by RT-PCR of BMP-7 and TGF-β1 in the kidney of mice in various group (±s.n=5)

    * P <0.05 vs NG;▲P <0.05 vs MG.

    Group BMP-7 TGF-β 1 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 1.57 ±0.09 1.55 ±0.27 1.65 ±0.61 0.33 ±0.05 0.34 ±0.02 0.35 ±0.01 MG 0.84 ±0.26* 0.86 ±0.33* 0.87 ±0.37* 0.53 ±0.05* 0.59 ±0.06* 0.53 ±0.07*TRG 1.11 ±0.47*▲ 1.23 ±0.20▲ 0.97 ±0.35* 0.37 ±0.03▲ 0.39 ±0.05▲ 0.37 ±0.02▲

    討 論

    黃芪注射液為傳統(tǒng)中藥黃芪提取物的滅菌水溶液(10 mL 相當于生藥材20 g),主要成分為黃芪多糖、黃酮、黃芪皂苷等,具有益氣養(yǎng)元,扶正祛邪,養(yǎng)心通脈的功效。臨床研究證實黃芪注射液能降糖調(diào)脂,改善糖尿病腎病患者的腎功能[1]。葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根提取物的滅菌水溶液,主要成分為葛根素,為由豆科植物野葛干燥根中提出的一種黃酮苷,其亦為臨床證明有效的單味中藥提取物,實驗研究有明顯的降血糖作用[2]。我們的實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠出現(xiàn)精神不振,活動遲緩,尿量明顯增多,體毛缺乏光澤等癥狀,而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組小鼠以上情況得到不同程度的改善。模型組和治療組各時點體重均比正常組增長明顯,但是與模型組相比,治療組20 ~28 周小鼠體重增長減緩。糖尿病模型組小鼠血糖、TG、TC 和SCr 較正常組升高,治療組上述指標仍高于正常組,但較模型組明顯下降,尤其是在治療早期,下降更為明顯,提示黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液有降血糖、降血脂、保護腎功能的作用。

    DN 是糖尿病慢性并發(fā)癥,在糖尿病早期尚無腎功損害時,腎臟內(nèi)環(huán)境及超微結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)改變。DN 早期病理改變?yōu)槟I小球體積擴大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生,晚期為腎小球和腎間質(zhì)纖維化,病變本質(zhì)是細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡,ECM 過度積聚和沉積。其中由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)而來的肌成纖維細胞(MFB)能合成大量ECM。很多因素參與促進ECM 的沉積,TGF-β1的作用受到廣泛關(guān)注[3]。TGF-β1在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,包括:促進ECM 成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的合成;抑制ECM 的降解;促進整合素的表達而增強細胞與基質(zhì)的作用;促進腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化等[4-5]。

    機體內(nèi)還存在一種天然拮抗TGF-β1的因子,即BMP-7。它可促進胚胎期腎臟發(fā)育過程中間充質(zhì)細胞向上皮細胞的分化,是胚胎腎臟發(fā)育分化及生長不可缺少的重要因子,在成年哺乳動物腎臟中會持續(xù)高度表達。Gould 等[6]證實在腎臟損傷修復的過程中,BMP-7 高表達,根據(jù)其及其受體在腎臟獨特的表達及分布方式推測,它可能具有保護腎臟、防御損傷的作用?,F(xiàn)已證實:BMP-7 可以通過影響TGF-β1/Smad 信號通路阻斷腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化進程,發(fā)揮抗纖維化作用[7]。DN 動物模型中,腎臟BMP-7 及其受體的表達明顯下降,下降幅度與腎纖維化的程度平行[8],給予外源性BMP-7 治療能明顯延緩DN 的進程,部分逆轉(zhuǎn)腎小球肥大,改善腎功能[9]。

    我們的免疫組化結(jié)果顯示,模型組小鼠與正常組比較,腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1強陽性表達,腎小球內(nèi)也可見表達,但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯,且其表達隨周齡增長而增多。治療組小鼠腎組織TGF-β1蛋白表達均較模型組明顯降低,差異顯著。RT-PCR 結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟TGF-β1mRNA 表達比正常組小鼠高,治療組小鼠TGF-β1mRNA 表達比模型組表達降低;模型組小鼠腎臟BMP-7 mRNA 表達比正常組小鼠低,20周齡和24 周齡治療組小鼠BMP-7 mRNA 表達比模型組高。這表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2型糖尿病腎病模型KKAy小鼠的腎臟保護作用可能是部分通過抑制DN 腎臟中TGF-β1的表達,并通過增加腎臟組織BMP-7 的表達從而拮抗TGF- β1的致纖維化作用來實現(xiàn)的。本研究為黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液治療DN 提供了實驗依據(jù)。

    [1] 劉儀紅,田浩明.黃芪治療糖尿病腎病的系統(tǒng)評價[J].中國循證醫(yī)學雜志,2007,7(10):715-727.

    [2] 歷淑芬,劉海清,從曉東. 葛根素注射液的藥理作用研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥,2010,23(4):587-589.

    [3] Song Y,Li C,Cai L. Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor mediated extracellular matrix accumulation[J]. Exp Mol Pathol,2004,76(1):66-75.

    [4] Docherty NG,Osullivan OE,Healy DA,et al. TGF-β1-induced EMT can occur independently of its proapoptotic effects and is aided by EGF receptor activation[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(5):F1202-F1212.

    [5] Lin H,Wang D,Wu T,et al. Blocking core fucosylation of TGF- β1receptors downregulates their functions and attenuates the epithelial-mesenchymal transition of renal tubular cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol,2011,300(4):F1017-F1025.

    [6] Gould SE,Day M,Jones SS,et al. BMP-7 regulates chemokine,cytokine,and hemodynamic gene expression in proximal tubule cells[J]. Kidney Int,2002,61(1):51-60.

    [7] Bechtel W,Zisberg M. Bone morphogenic protein-7 and the kidneys:insights into the future management of chronic kidney diseases[J]. Dtsch Med Wochenschr,2009,134(34-35):1688-1691.

    [8] Wang SN,Lapage J,Hirschberg R. Loss of tubular bone morphogenetic protein-7 in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol,2001,12(11):2392-2399.

    [9] Wang S,Caestecker M,Kopp J,et a1. Renal bone morphogenetie protein-7 protects against diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol,2006,17(9):2504-2512.

    猜你喜歡
    葛根素腎小管周齡
    渝州白鵝剩余采食量測定及其與飼料利用效率相關(guān)性狀的相關(guān)分析
    申鴻七彩雉血液生化指標和肌內(nèi)脂肪含量的測定及其相關(guān)性分析
    葛根素抑制小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的作用
    寧都黃公雞睪丸質(zhì)量與不同周齡第二性征的回歸與主成分分析
    葛根素對高糖誘導HUVEC-12細胞氧化損傷的保護作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    葛根素生物黏附微球的制備及評價
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    褐殼蛋雞
    依帕司他對早期糖尿病腎病腎小管功能的影響初探
    IgA腎病患者血清胱抑素C對早期腎小管間質(zhì)損害的預測作用
    細胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過程中的作用
    亚洲精华国产精华精| 国产欧美日韩精品亚洲av| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩综合久久久久久 | 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本与韩国留学比较| 亚洲专区中文字幕在线| 我的老师免费观看完整版| 国内精品一区二区在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99久久精品一区二区三区| 18+在线观看网站| 一本综合久久免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 成人一区二区视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 日本黄色片子视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品亚洲av一区麻豆| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中国美女看黄片| 一本久久中文字幕| 国产精华一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久 | 久久人人精品亚洲av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品影院久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产私拍福利视频在线观看| 香蕉av资源在线| www.色视频.com| 亚洲av免费在线观看| 宅男免费午夜| 久久久成人免费电影| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av免费在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 天堂动漫精品| 欧美一区二区亚洲| 黄色视频,在线免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品久久国产高清桃花| 嫩草影院入口| 久久性视频一级片| 国产美女午夜福利| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 性欧美人与动物交配| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久九九精品影院| 成人午夜高清在线视频| 亚洲精华国产精华精| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人无遮挡网站| 久久性视频一级片| 国产人妻一区二区三区在| 午夜激情欧美在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 在线播放国产精品三级| 国产av一区在线观看免费| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国内精品久久久久久久电影| 国产真实乱freesex| 精品无人区乱码1区二区| 国产视频内射| 亚洲精品456在线播放app | 99riav亚洲国产免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精华一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 国产成人aa在线观看| 日韩亚洲欧美综合| x7x7x7水蜜桃| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中亚洲国语对白在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久国产精品人妻蜜桃| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品电影一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲成人久久性| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 91av网一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费高清视频大片| 亚州av有码| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产欧美人成| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 毛片一级片免费看久久久久 | 午夜福利高清视频| 免费看a级黄色片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久精品国产自在天天线| 亚洲综合色惰| 国产精品av视频在线免费观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av美国av| 听说在线观看完整版免费高清| 两个人视频免费观看高清| 成人av在线播放网站| 人妻久久中文字幕网| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 午夜视频国产福利| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 搞女人的毛片| 观看免费一级毛片| 国产精品伦人一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 在线观看一区二区三区| 久久香蕉精品热| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩欧美国产在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av一区综合| 国产成年人精品一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美色视频一区免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 又爽又黄无遮挡网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 美女被艹到高潮喷水动态| 激情在线观看视频在线高清| 中文字幕av成人在线电影| 久久人人爽人人爽人人片va | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日本与韩国留学比较| 欧美午夜高清在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免 | 久久久精品大字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产高清视频在线播放一区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产一区二区在线av高清观看| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 91麻豆av在线| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 露出奶头的视频| 国产高清有码在线观看视频| 俺也久久电影网| 久久草成人影院| 成人欧美大片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久亚洲精品不卡| 欧美性猛交黑人性爽| 一区二区三区免费毛片| 亚洲国产色片| 亚洲久久久久久中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线观看66精品国产| 日韩精品青青久久久久久| 丰满的人妻完整版| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲人成网站在线播| av专区在线播放| 国产老妇女一区| 男人舔女人下体高潮全视频| 极品教师在线免费播放| 在线观看午夜福利视频| 成人亚洲精品av一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲经典国产精华液单 | 麻豆国产av国片精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 人人妻人人看人人澡| 国产精品一区二区性色av| 国产不卡一卡二| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩av在线大香蕉| 少妇人妻精品综合一区二区 | 热99re8久久精品国产| 99riav亚洲国产免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| bbb黄色大片| 亚洲在线观看片| 亚洲专区国产一区二区| 国产野战对白在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精华国产精华精| 成人鲁丝片一二三区免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 少妇高潮的动态图| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品色激情综合| 欧美在线一区亚洲| 三级毛片av免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 精品久久国产蜜桃| 久久久色成人| 日本在线视频免费播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜福利高清视频| 热99在线观看视频| av在线天堂中文字幕| 亚洲欧美日韩高清专用| 日韩欧美在线二视频| 国产伦在线观看视频一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲内射少妇av| 久久久久九九精品影院| 色av中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 天堂动漫精品| 十八禁人妻一区二区| 99久国产av精品| 中文资源天堂在线| 国产老妇女一区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美一区二区亚洲| 午夜激情福利司机影院| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 嫩草影院新地址| 99久久精品国产亚洲精品| 怎么达到女性高潮| 亚洲成人免费电影在线观看| 最新中文字幕久久久久| 69人妻影院| 国产精品伦人一区二区| 午夜视频国产福利| 悠悠久久av| www.999成人在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 观看免费一级毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 国产主播在线观看一区二区| 成人午夜高清在线视频| xxxwww97欧美| 国产探花在线观看一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 色播亚洲综合网| 色综合欧美亚洲国产小说| 韩国av一区二区三区四区| 日韩人妻高清精品专区| 成年女人永久免费观看视频| 能在线免费观看的黄片| 窝窝影院91人妻| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男女视频在线观看网站免费| 婷婷丁香在线五月| 亚洲成av人片在线播放无| 中文字幕av成人在线电影| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产综合懂色| 麻豆成人av在线观看| 一a级毛片在线观看| 18禁在线播放成人免费| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 看片在线看免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 久久亚洲精品不卡| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久草成人影院| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜福利18| 色哟哟·www| 久99久视频精品免费| 免费人成在线观看视频色| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久99热这里只有精品18| 亚洲五月天丁香| 国产美女午夜福利| 亚洲av不卡在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品人妻视频免费看| 日韩欧美免费精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 村上凉子中文字幕在线| 一夜夜www| 老司机福利观看| 成年版毛片免费区| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美zozozo另类| 国产精品永久免费网站| 久久香蕉精品热| 亚洲av成人av| 两人在一起打扑克的视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国内揄拍国产精品人妻在线| 天天躁日日操中文字幕| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久久九九精品二区国产| 我要看日韩黄色一级片| 美女高潮的动态| av天堂中文字幕网| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜激情欧美在线| 91狼人影院| 午夜影院日韩av| www.www免费av| 精品福利观看| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲五月婷婷丁香| a级一级毛片免费在线观看| 日韩中字成人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美国产日韩亚洲一区| 久久国产精品影院| 国产成年人精品一区二区| 好男人在线观看高清免费视频| 国产探花在线观看一区二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 极品教师在线免费播放| 特大巨黑吊av在线直播| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品一及| 亚洲人成电影免费在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 内地一区二区视频在线| 丁香六月欧美| .国产精品久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| eeuss影院久久| 麻豆国产97在线/欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产成人a区在线观看| 国产在线男女| 黄色一级大片看看| 好男人电影高清在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久国产成人免费| 99久国产av精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 波野结衣二区三区在线| 男人舔奶头视频| www日本黄色视频网| 久久精品国产清高在天天线| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久午夜福利片| 精品日产1卡2卡| 特级一级黄色大片| 高清日韩中文字幕在线| bbb黄色大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费av毛片视频| 亚洲人成电影免费在线| 成人永久免费在线观看视频| 99久久精品热视频| 国产麻豆成人av免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 免费av毛片视频| 美女 人体艺术 gogo| 色综合婷婷激情| avwww免费| 性色avwww在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产三级在线视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 少妇的逼水好多| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 欧美最新免费一区二区三区 | ponron亚洲| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| ponron亚洲| 嫁个100分男人电影在线观看| 成年版毛片免费区| 偷拍熟女少妇极品色| 成人欧美大片| avwww免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 五月伊人婷婷丁香| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 1000部很黄的大片| 免费看美女性在线毛片视频| 国产色爽女视频免费观看| 国产一区二区三区视频了| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久国产a免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人av一区二区三区在线看| 毛片一级片免费看久久久久 | 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜两性在线视频| av在线天堂中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产探花在线观看一区二区| 欧美在线黄色| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 天堂√8在线中文| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品亚洲一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久人妻av系列| 精品久久久久久,| 国产淫片久久久久久久久 | 日韩欧美在线乱码| 乱码一卡2卡4卡精品| 中文字幕av成人在线电影| 欧美黑人巨大hd| 丁香六月欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| xxxwww97欧美| 国产精品国产高清国产av| 少妇被粗大猛烈的视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲av.av天堂| a在线观看视频网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 免费高清视频大片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品人妻熟女av久视频| 国产极品精品免费视频能看的| 一个人观看的视频www高清免费观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品伦人一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 美女大奶头视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久久久久成人| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清在线国产一区| 亚洲精品一区av在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲 国产 在线| www.www免费av| 欧美日韩综合久久久久久 | 成人国产一区最新在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人无遮挡网站| 9191精品国产免费久久| 十八禁网站免费在线| 精品久久久久久久久久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本黄色片子视频| 日韩精品青青久久久久久| 国产精华一区二区三区| av福利片在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 成人永久免费在线观看视频| 90打野战视频偷拍视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲av免费在线观看| 日本在线视频免费播放| 少妇丰满av| 国产视频内射| 久久热精品热| 亚洲av免费高清在线观看| 久久香蕉精品热| 啪啪无遮挡十八禁网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费大片18禁| 亚洲无线观看免费| 舔av片在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久中文看片网| 又爽又黄a免费视频| avwww免费| 亚洲av电影不卡..在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲电影在线观看av| 性色avwww在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美色视频一区免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一级作爱视频免费观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产毛片a区久久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费观看人在逋| 欧美激情国产日韩精品一区| 嫩草影院精品99| 欧美日本视频| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲午夜理论影院| 深爱激情五月婷婷| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av一区综合| 免费看光身美女| 国产高清有码在线观看视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 91在线精品国自产拍蜜月| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av熟女| 免费无遮挡裸体视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲精品久久久com| 国产午夜福利久久久久久| 成年人黄色毛片网站| 1000部很黄的大片| 国产人妻一区二区三区在| 不卡一级毛片| 一级作爱视频免费观看| 日韩欧美 国产精品| 少妇人妻精品综合一区二区 | 麻豆成人av在线观看| 免费观看人在逋| 99精品在免费线老司机午夜| 搡老岳熟女国产| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日本三级黄在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久久久久精品吃奶| 真实男女啪啪啪动态图| 免费看a级黄色片| 成人午夜高清在线视频| 一本精品99久久精品77| 美女大奶头视频| 99久国产av精品| 91av网一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品久久久久久久久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久精免费| 精品久久久久久久久av| 亚洲午夜理论影院| 一夜夜www| 精品福利观看| 午夜老司机福利剧场| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久国产成人免费| 男人舔奶头视频| 久久草成人影院| 久久这里只有精品中国| av黄色大香蕉| 天堂√8在线中文| 欧美高清成人免费视频www| 51午夜福利影视在线观看| 伦理电影大哥的女人| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 大型黄色视频在线免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产人妻一区二区三区在| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲三级黄色毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲精品在线美女| 国产成人av教育| 日韩欧美精品v在线| 直男gayav资源| 国产av不卡久久| 国产午夜精品论理片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品久久久久久久电影|