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    黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病KKAy小鼠腎臟TGF-β1和BMP-7 表達的影響*

    2012-12-23 04:07:30李姝玉柴新樓賈德賢蘇瑋蓮
    中國病理生理雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:葛根素腎小管周齡

    李姝玉, 柴新樓, 吳 瑩, 賈德賢, 郝 鈺, 蘇瑋蓮, 王 謙△

    (1北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,北京100029;2天津醫(yī)科大學,天津300070)

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見而難治的微血管并發(fā)癥,是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。在DN 發(fā)病過程中,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)起著關(guān)鍵的作用,可以促進糖尿病腎小球纖維化和間質(zhì)纖維化過程的發(fā)生、發(fā)展。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性腎臟保護因子,具有抗纖維化的作用,能夠拮抗TGF-β1的作用。黃芪和葛根是治療DN 的常用中藥,能有效改善腎臟功能,然而,其作用機制尚缺乏充分了解。因此,本研究觀察黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2 型糖尿病腎病模型KKAy小鼠腎臟TGF-β1和BMP-7 表達的影響,探討黃芪注射液和葛根素注射液治療DN 的有關(guān)作用機制。

    材 料 和 方 法

    1 動物

    SPF 級KKAy小鼠40 只,雄性,9 ~11 周齡,25 ~28 g,購自中國醫(yī)學科學院動物中心,許可證號為SCXK(京)2005-0013,隨機血糖≥13.9mol/L,確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J 小鼠18 只,雄性,9 ~11周齡,23 ~25 g,許可證號為SCXK(京)2003-0003,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗期間,動物自由飲水,KKAy小鼠給予高脂飼料(中國醫(yī)學科學院動物中心提供),C57BL/6J 小鼠給予生長維持顆粒飼料(購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司),以上動物均飼養(yǎng)在中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)。

    2 藥物與試劑

    黃芪注射液購自成都地奧九泓制藥廠,規(guī)格為每毫升含生藥2 g,產(chǎn)品批號為0608056。葛根素注射液購自浙江康恩貝制藥股份有限公司,規(guī)格為每毫升含葛根素50 mg,產(chǎn)品批號為0601013。TGF-β1兔抗多克隆抗體和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及高敏過氧化物復合酶購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol 購自Invitrogen,RT-PCR有關(guān)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,TGF-β1上游引物序列5'-TCCCTCAACCTCAAATTATTCA-3',下游引物序列5'-GCGGTCCACCATTAGCAC-3',擴增后片段長度為493 bp;BMP-7 上游引物序列5'-GACGCCAAAGAACCACAAGAG-3',下游引物序列5'-TCACAGTAGTAGGCAGCATAGC-3',擴增后片段長度為165 bp;β-actin 上游引物序列5'-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3',下游引物序列5'-CACGTCACACTTCATGATGGAG-3',擴增后片段長度為243 bp。

    3 主要儀器

    Freestyle 利舒坦血糖儀,日立7600P 全自動生化分析儀,Eppendorf RT-PCR 儀,紫外分光光度計,凝膠成像儀。

    4 方法

    4.1 動物分組及給藥方法 KKAy小鼠飼養(yǎng)至14周齡時,將其按照隨機血糖分組:模型組(model group,MG)20 只;治療組(treatment group,TRG)20只,每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL·kg-1·d-1)和葛根素注射液(1.3 mL·kg-1·d-1),2 種藥物先后給藥。18 只C57BL/6J 小鼠作為正常組(normal group,NG)。實驗期間,各組動物自由飲食、飲水。分別于20 周齡、24 周齡和28 周齡處死動物。

    4.2 小鼠一般狀態(tài)及體重變化 每天觀察小鼠一般狀態(tài),隔周稱量各組小鼠體重。

    4.3 血清生化指標檢測 剪尾檢測20 周齡、24 周齡和28 周齡各組小鼠空腹血糖(blood glucose,BG)。20 周齡小鼠禁食12 ~14 h 后,處死動物,眼球取血,分離血清,日本日立7600P 全自動生化分析儀測定血清甘油三酯(triglyceride,TG)、膽固醇(cholesterol,TC)及血肌酐(serum creatinine,SCr)。24 周齡和28 周齡小鼠指標檢測方法同上。

    4.4 免疫組織化學染色 將石蠟包埋的腎組織制成4 μm 厚的切片,用SABC 法檢測腎組織TGF-β1的蛋白表達情況。以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。每張切片隨機選取6 個高倍視野,每組選取6 張切片,Olympus 公司圖像采集系統(tǒng)采集圖像,Image-Pro Plus 5.1 圖像分析軟件進行半定量分析。

    4.5 RT-PCR 檢測腎組織TGF-β1和BMP-7 mRNA 表達 按照Trizol 說明書提取腎組織總RNA,紫外分光光度計測定總RNA 質(zhì)量與濃度。每組分別取5 μg 先進行逆轉(zhuǎn)錄反應,反應結(jié)束后分別取4 μL 反應產(chǎn)物,進行多聚酶鏈(PCR)反應,TGFβ1、BMP-7 和β-actin 的退火溫度均為50 ℃,95℃5 min,95 ℃30 s,50 ℃30 s,72 ℃40 s,擴增36輪。PCR 產(chǎn)物的電泳分析:取10 μL 產(chǎn)物,進行2%瓊脂糖凝膠電泳,電泳后于紫外燈下根據(jù)PCR marker 位置判斷目標產(chǎn)物,拍照后進行灰度掃描,分別計算TGF-β1和BMP-7 擴增產(chǎn)物的吸光度值與β-actin 擴增產(chǎn)物的吸光度值的比值作為表達水平參數(shù),進行半定量分析。

    5 統(tǒng)計學處理

    結(jié) 果

    1 一般狀態(tài)及體重變化情況

    模型組小鼠有精神不振,活動遲緩,尿量明顯增多,體毛缺乏光澤,而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。模型組28 周齡小鼠有1 只死亡。模型組小鼠各時點體重均比正常組增長明顯,差異顯著(P <0.01)。治療組小鼠20、24 周齡體重均比正常組增長明顯,差異顯著(P<0.01);與模型組相比,治療組20 ~28 周小鼠體重增長減緩,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05 或P <0.01),見表1。

    表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

    表1 各組小鼠體重檢測結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

    **P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG. NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.

    Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 25.68 ±4.49(n=6) 30.17 ±1.94(n=6) 32.83 ±3.66 (n=6)MG 41.42 ±2.53**(n=6) 45.13 ±2.09**(n=6) 43.28 ±3.65**(n=7)TRG 36.47 ±3.23**▲(n=6) 39.93 ±3.31**▲▲(n=6) 35.87 ±4.91▲▲(n=8)

    2 血清生化指標檢測結(jié)果

    從20 周齡開始,模型組及治療組小鼠血糖比正常組高,差異顯著(P <0.01),治療組小鼠空腹血糖較模型組降低,差異顯著(P <0.05 或P <0.01),見表2。模型組SCr 自24 周齡開始明顯升高,與正常組相比差異顯著(P <0.01);治療組小鼠24 及28 周齡時SCr 水平較模型組明顯降低(P <0.01),并且28 周齡時高于正常組(P <0.05),見表2。模型組自20 周齡開始,TG 和TC 明顯升高,與正常組小鼠相比差異顯著(P <0.01);20 和28 周齡時治療組小鼠TG 較模型組有所降低,24 周齡時,治療組小鼠TC 較模型組明顯降低(P <0.01),見表3。

    表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

    表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

    * P <0.05,**P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG.

    Group BG(mmol/L)SCr(μmol/L)20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 5.21±0.95 (n=6) 4.25±1.28(n=6) 3.54±1.06(n=6) 10.05±1.13(n=6) 6.21±2.00(n=6) 9.42±2.60(n=6)MG 22.50±2.69**(n=6) 20.85±5.86**(n= 6) 12.54±2.36**(n=7) 9.45±1.41(n=6) 12.08±1.14**(n=6) 19.17±3.38**(n=7)TRG 13.68±3.15**▲▲(n= 6)14.83±3.21**▲(n=6) 7.00±1.51**▲▲(n=8) 10.10±1.12(n=6) 7.70±0.90▲▲(n=6) 13.36±3.07*▲▲(n=8)

    表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

    表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

    **P <0.01 vs NG;▲P <0.05,▲▲P <0.01 vs MG.

    Group TG TC 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 0.15±0.03(n=6) 0.64±0.06(n=6) 0.65±0.24 (n=6) 2.53±0.23(n=6) 2.04±0.24(n=6) 2.10±0.34(n=6)MG 0.25±0.02**(n=6) 2.20±0.44**(n=6) 1.68±0.60**(n=7) 5.21±1.17**(n=6) 6.48±0.50**(n=6) 6.18±1.73**(n=7)TRG 0.19±0.05▲▲(n=6) 1.79±0.48**(n=6) 1.13±0.48▲(n=8) 5.13±0.85(n=6) 3.86±1.00**▲▲(n=6) 5.43±0.90**(n=8)

    3 免疫組化染色結(jié)果

    正常組腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞胞漿中均有較弱的TGF-β1表達,見圖1A;模型組與正常組比較,腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1強陽性表達,腎小球內(nèi)也可見表達,但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯,且其表達隨周齡增長而增多,見圖1B。治療組小鼠TGF-β1在腎小球和腎小管的表達均較模型組明顯降低,差異顯著(P <0.01),見圖1C、表4。

    4 RT-PCR 檢測TGF-β1和BMP-7 mRNA 的表達

    各周齡模型組小鼠腎臟TGF-β1mRNA 表達均比正常組小鼠高,治療組小鼠TGF-β1mRNA 表達比模型組低,差異顯著(P <0.05);各周齡模型組小鼠腎臟BMP-7 mRNA 表達均比正常組小鼠低,20和24 周齡治療組小鼠BMP-7 mRNA 表達比模型組高,差異顯著(P <0.05),28 周齡治療組與模型組無顯著差異,見圖2、表5。

    Figure 1. Expression of TGF-β1 in renal tissues from each group at the end of 24 weeks (immunohistochemical staining, × 400). A:normal group;B:model group;C:treatment group.圖1 24 周齡各組小鼠腎組織TGF-β1 免疫組化染色

    表4 各組小鼠腎臟TGF-β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF-β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

    表4 各組小鼠腎臟TGF-β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF-β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

    **P <0.01 vs NG;▲▲P <0.01 vs MG.

    Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 20 475.72 ±5 204.95 21 363.45 ±5 111.88 22 598.90 ±5 381.02 MG 94 385.10 ±16 695.46** 142 483.97 ±7 149.30** 192 384.28 ±6 480.86**TRG 28 405.74 ±11 981.22▲▲ 70 242.29 ±7 839.27**▲▲ 63 171.88 ±5 075.73**▲▲

    Figure 2. TGF-β1 and BMP-7 mRNA expression in renal tissues from each group at the end of 24 weeks. M:marker;NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.圖2 24 周齡各組小鼠腎組織TGF-β1 和BMP-7 mRNA 表達情況

    表5 各組小鼠腎臟BMP-7 和TGF-β1 的RT-PCR 圖像分析結(jié)果Table 5. Image analysis results examined by RT-PCR of BMP-7 and TGF-β1 in the kidney of mice in various group (±s.n=5)

    * P <0.05 vs NG;▲P <0.05 vs MG.

    Group BMP-7 TGF-β 1 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 1.57 ±0.09 1.55 ±0.27 1.65 ±0.61 0.33 ±0.05 0.34 ±0.02 0.35 ±0.01 MG 0.84 ±0.26* 0.86 ±0.33* 0.87 ±0.37* 0.53 ±0.05* 0.59 ±0.06* 0.53 ±0.07*TRG 1.11 ±0.47*▲ 1.23 ±0.20▲ 0.97 ±0.35* 0.37 ±0.03▲ 0.39 ±0.05▲ 0.37 ±0.02▲

    討 論

    黃芪注射液為傳統(tǒng)中藥黃芪提取物的滅菌水溶液(10 mL 相當于生藥材20 g),主要成分為黃芪多糖、黃酮、黃芪皂苷等,具有益氣養(yǎng)元,扶正祛邪,養(yǎng)心通脈的功效。臨床研究證實黃芪注射液能降糖調(diào)脂,改善糖尿病腎病患者的腎功能[1]。葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根提取物的滅菌水溶液,主要成分為葛根素,為由豆科植物野葛干燥根中提出的一種黃酮苷,其亦為臨床證明有效的單味中藥提取物,實驗研究有明顯的降血糖作用[2]。我們的實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠出現(xiàn)精神不振,活動遲緩,尿量明顯增多,體毛缺乏光澤等癥狀,而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組小鼠以上情況得到不同程度的改善。模型組和治療組各時點體重均比正常組增長明顯,但是與模型組相比,治療組20 ~28 周小鼠體重增長減緩。糖尿病模型組小鼠血糖、TG、TC 和SCr 較正常組升高,治療組上述指標仍高于正常組,但較模型組明顯下降,尤其是在治療早期,下降更為明顯,提示黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液有降血糖、降血脂、保護腎功能的作用。

    DN 是糖尿病慢性并發(fā)癥,在糖尿病早期尚無腎功損害時,腎臟內(nèi)環(huán)境及超微結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)改變。DN 早期病理改變?yōu)槟I小球體積擴大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生,晚期為腎小球和腎間質(zhì)纖維化,病變本質(zhì)是細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡,ECM 過度積聚和沉積。其中由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(EMT)而來的肌成纖維細胞(MFB)能合成大量ECM。很多因素參與促進ECM 的沉積,TGF-β1的作用受到廣泛關(guān)注[3]。TGF-β1在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,包括:促進ECM 成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的合成;抑制ECM 的降解;促進整合素的表達而增強細胞與基質(zhì)的作用;促進腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化等[4-5]。

    機體內(nèi)還存在一種天然拮抗TGF-β1的因子,即BMP-7。它可促進胚胎期腎臟發(fā)育過程中間充質(zhì)細胞向上皮細胞的分化,是胚胎腎臟發(fā)育分化及生長不可缺少的重要因子,在成年哺乳動物腎臟中會持續(xù)高度表達。Gould 等[6]證實在腎臟損傷修復的過程中,BMP-7 高表達,根據(jù)其及其受體在腎臟獨特的表達及分布方式推測,它可能具有保護腎臟、防御損傷的作用?,F(xiàn)已證實:BMP-7 可以通過影響TGF-β1/Smad 信號通路阻斷腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化進程,發(fā)揮抗纖維化作用[7]。DN 動物模型中,腎臟BMP-7 及其受體的表達明顯下降,下降幅度與腎纖維化的程度平行[8],給予外源性BMP-7 治療能明顯延緩DN 的進程,部分逆轉(zhuǎn)腎小球肥大,改善腎功能[9]。

    我們的免疫組化結(jié)果顯示,模型組小鼠與正常組比較,腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1強陽性表達,腎小球內(nèi)也可見表達,但不如腎小管上皮細胞胞漿表達明顯,且其表達隨周齡增長而增多。治療組小鼠腎組織TGF-β1蛋白表達均較模型組明顯降低,差異顯著。RT-PCR 結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟TGF-β1mRNA 表達比正常組小鼠高,治療組小鼠TGF-β1mRNA 表達比模型組表達降低;模型組小鼠腎臟BMP-7 mRNA 表達比正常組小鼠低,20周齡和24 周齡治療組小鼠BMP-7 mRNA 表達比模型組高。這表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2型糖尿病腎病模型KKAy小鼠的腎臟保護作用可能是部分通過抑制DN 腎臟中TGF-β1的表達,并通過增加腎臟組織BMP-7 的表達從而拮抗TGF- β1的致纖維化作用來實現(xiàn)的。本研究為黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液治療DN 提供了實驗依據(jù)。

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