Ezrin蛋白在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)研究及其與HPV16/18感染的相關(guān)性

張 帆 楊可達(dá)

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長沙 410008；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚科，湖南長沙 410008

宮頸癌是婦科臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，近年來臨床發(fā)病率呈現(xiàn)上升及年輕化的趨勢，由于該病患者病死率較高，嚴(yán)重威脅了廣大女性的健康[1]。最新研究表明，埃茲蛋白（Ezrin）)是惡性腫瘤的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其主要是通過調(diào)節(jié)黏附分子及信號傳導(dǎo)等途徑實(shí)現(xiàn)的[2]。本研究對Ezrin蛋白的表達(dá)與宮頸癌關(guān)系及其與人乳頭瘤病毒（HPV）感染的相關(guān)性作進(jìn)一步探討，旨在為Ezrin蛋白的臨床輔助作用奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年10月—2011年12月期間，我院婦科進(jìn)行手術(shù)治療的宮頸癌患者113例，年齡42～65歲之間，平均年齡（54.62±12.81）歲。依據(jù)宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷報(bào)告（TBS）分類系統(tǒng)，其中19例為不能明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC－US）；14例為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），均經(jīng)病理切片診斷為CINⅠ；49例為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL），經(jīng)病理切片診斷為CINⅡ～Ⅲ；以及31宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）患者，經(jīng)病理切片確診為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本的處理 采用宮頸刷收集患者的宮頸脫落細(xì)胞樣本，用4%甲醛溶液固定48h后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，對Ezrin蛋白進(jìn)行免疫組化SP法檢測。剩余細(xì)胞進(jìn)行消化處理：50 mmol/L Tris，pH8.0；1 mol/L EDTA，pH8.0；0.5% 吐 溫－20，0.2μg/μL 蛋 白酶 K，ddH2O；55℃水浴 2～3 h后離心，濃縮至 20 μL后可作為DNA模板進(jìn)行HPV16/18的檢測。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測Ezrin蛋白 采用免疫組化SP法檢測Ezrin蛋白的表達(dá)情況，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。陽性對照采用已知陽性片，陰性對照采用PBS代替第一抗體。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[3]：分別采用低倍和高倍鏡觀察全片，Ezrin陽性染色為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在相同放大倍數(shù)(×400)下隨機(jī)選取切片的5個(gè)視野，并隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)＜5%時(shí)為陰性(－)，當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性(＋)。

1.2.3 多重引物PCR技術(shù)檢測HPV16/18 HPV16的特異性引物選擇E6、E7基因區(qū)，擴(kuò)增長度395 bp；HPV18的特異性引物選擇L1基因區(qū)，擴(kuò)增長度116 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性8～10 min，94 ℃變性 30 s，53～55℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，32 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，395bp及116bp為陽性條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，陽性率對比分析采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)

與 ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及 CSCC患者 Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表達(dá)的陽性率明顯提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表 1。

表1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 Ezrin蛋白與HPV16/18DNA表達(dá)的相關(guān)性

Ezrin蛋白與HPV16/18 DNA表達(dá)，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析，二者呈現(xiàn)正相關(guān)（rs＝0.768,P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是由HPV病毒直接通過皮膚接觸而傳播的惡性腫瘤，已有研究證明，在宮頸癌的發(fā)病初期患者幾乎是沒有任何臨床癥狀的，當(dāng)病情發(fā)展到一定階段后才會出現(xiàn)異常陰道流血現(xiàn)象[4]。同時(shí)HPV病毒感染與宮頸上皮瘤樣變的發(fā)生密切相關(guān)，但其并不是細(xì)惡性轉(zhuǎn)化的唯一因素，需要其他致病因素的共同存在。埃茲蛋白(Ezrin)作為膜細(xì)胞骨架連接蛋白，屬于ERM(Ezrin、Radixin、Moesin)成員之一，其能夠參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的作用，在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用[5]。

本研究結(jié)果表明，與ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及CSCC患者Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表達(dá)的陽性率明顯提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且二者呈正相關(guān)。由此可見，Ezrin蛋白早期宮頸癌的篩查具有重要意義，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]曹翠明,周亞濱,張麗.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測宮頸脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒16/18型和巨細(xì)胞病毒的協(xié)同作用[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2006,17(5):7－8.

[2]Khanna C,Wan XL,Bose S,et al.The membrane－cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis[J].Nat Med,2004,10(2):182－186.

[3]王秋蘭.宮頸癌中Ezrin和Survivin的表達(dá)及其與浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中國婦幼保健,2010,25(10):1405－1407.

[4]申鵬,蘇寧,陳斌,等.埃茲蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌增值及轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(6):737－739.

[5]徐飛,吳強(qiáng),孫志華,等.宮頸癌中Ezrin和CD44－V6的表達(dá)及其相關(guān)性[J].江蘇醫(yī)藥,2010,36(21):2494－2496.