抗癌藥SN38通過脂筏促進Fas介導的細胞凋亡

曹 妍 王大南 孫 玥 梅原久範 呂昌龍

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，沈陽110001)

Fas(CD95/APO-1)與Fas配體或者抗Fas抗體(CH11)結合，在胞漿形成死亡受體誘導的信號復合體(DISC)，可進一步活化caspase分子，介導細胞凋亡。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothecin)可通過抑制拓撲異構酶Ⅰ(TopoisomeraseⅠ，TopoⅠ)選擇性殺傷S期細胞，具有廣泛的抗腫瘤譜［1，2］。

脂筏是細胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結構域(Microdomain)。鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂筏的重要組成成分。一些研究表明，Fas可以易位和聚集于脂筏所在區(qū)域［3，4］，脂筏通過促進DISC的形成進而活化caspase依賴的細胞死亡途徑［5］。本研究的前期結果顯示，SN38能夠加強WR/FASSMS1細胞Fas介導的凋亡現象，但對WR/Fas-SM(-)細胞凋亡的促進作用不明顯［6］。因此，本實驗擬探討在SN38和CH11的共同作用下，細胞內部到底有哪些DNA損傷的信號分子和caspase分子參與了這一過程?并且分析它們的活化強度和作用特點，進而明確該過程中脂筏的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 WR/Fas-SMS1細胞和WR/Fas-SM(-)細胞由日本金沢醫(yī)科大學血液免疫內科提供［7］。

1.2 主要試劑及儀器 0.4%臺盼藍(Gibco);RPMI1640培養(yǎng)液 500 ml(Gibco，Invitrogen);CH11(Medical＆Biological Laboratories， Japan);SN38(Yakult pharmaceutical，Japan);抗 phospho-ATM(Ser1981)、phospho-Chk1(Ser345)、phospho-p53(Ser15)、cleaved caspase-3(Asp175)、cleaved caspase-8(Asp391)和 α/βTubulin抗體購自 Cell Signaling Technologies Japan(Tokyo，Japan);抗phospho-p21、p21和 ATM抗體購自Santa Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA);抗 β-actin抗體購自Rockland Immunochemicals，Inc(Gilbertsville，PA，USA)。電泳裝置、轉膜裝置(Bio-Rad)。

1.3 細胞培養(yǎng) WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FASSMS1細胞常規(guī)復蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞處理 常規(guī)收集并且計數細胞，調整細胞濃度為5×105ml-1，接種24孔板，每孔1 ml。CO2細胞孵育箱中培養(yǎng)2小時后，分別加入不同濃度SN38和/或CH11刺激，混勻細胞后，放入CO2細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 蛋白樣品處理 收集5×105個細胞，離心，1 200 r/min，3分鐘，離心后棄上清。每管中加50 μl現配 lysing buffer，Vortex 5～10秒，劇烈震蕩，置于冰上30分鐘。每10分鐘震蕩一次。4℃離心，10 000 r/min，10分鐘。取上清與等體積的sample buffer混合，煮沸6分鐘。常溫離心，10 000 r/min，10分鐘。上清即為電泳的蛋白樣品。

1.6 Western blot 取處理后的蛋白樣品15μl于每個泳道中，同時設一個泳道加入6μl Rainbow marker，經6% ～15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉的TBS溶液封閉2小時，經TBST液洗膜5分鐘×3次后，再用TBS液洗膜5分鐘×1次。加入100倍稀釋的一抗，4℃過夜孵育。棄去一抗，TBST液洗膜5分鐘×3次，TBS液洗膜5分鐘×1次后，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育30分鐘。棄去二抗，再次TBST液洗膜5分鐘×3次，TBS液洗膜5分鐘×1次后，加入ECL發(fā)光液，染色1分鐘后，于暗室曝光顯像。

1.7 結果分析 應用QUANTISCAN DEMO軟件對電泳條帶進行密度分析，結果以目的條帶密度與內參條帶密度的比值形式表示。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5統(tǒng)計學分析軟件，用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞ATM活化水平的影響磷酸化ATM的表達水平在WR/FAS-SMS1細胞被SN38和CH11共同作用后的0.5和1小時升高，而在WR/FAS-SM(-)細胞中，沒有見到磷酸化ATM表達水平的升高?？侫TM的表達水平在兩種細胞中均未見明顯升高，見圖1。

2.2 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞Chk1活化水平的影響磷酸化Chk1在WR/FAS-SMS1細胞和WR/FAS-SM(-)細胞中的表達均呈現時間依賴關系，在1小時和3小時的時間點，Chk1的活化狀態(tài)在兩細胞之間存在顯著性差異，并且 Chk1的活化由 SN38而非CH11誘導，見圖2～4。

圖1 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后ATM的活化水平Fig.1 ATM activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖2 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后Chk1的活化水平Fig.2 Chk1 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖3 SN38和/或 CH11作用 WR/FAS-SM(-)和 WR/FAS-SMS1后Chk1的活化水平Fig.3 Chk1 activation during SN38 and/or CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖4 不同濃度CH11作用WR/FAS-SM(-)和WR/FASSMS1后Chk1的活化水平Fig.4 Chk1 activation during CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FAS-SMS1

圖5 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p53的活化水平Fig.5 p53 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖6 SN38和/或 CH11作用 WR/FAS-SM(-)和 WR/FAS-SMS1后p53的活化水平Fig.6 p53 activation during SN38 and/or CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖7 不同濃度CH11作用WR/FAS-SM(-)和WR/FASSMS1后p53的活化水平Fig.7 p53 activation during CH11 treatment of WR/FASSM(-)and WR/FAS-SMS1

2.3 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞p53活化水平的觀察 磷酸化p53在WR/FAS-SMS1細胞中的表達呈現時間依賴關系，在14小時時間點，磷酸化p53的表達水平在兩細胞之間存在顯著差異;CH11和SN38的共同作用雖使WR/FAS-SM(-)細胞p53活化，但無時間依賴關系，并且p53的活化由SN38而非CH11誘導，見圖5～7。

2.4 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞p21活化水平的觀察 磷酸化p21的表達水平在 WR/FAS-SMS1細胞被SN38和CH11共同作用后隨時間的延長而逐漸減弱，但是在WR/FAS-SM(-)細胞中則沒有表現出這種減弱的趨勢。當SN38單獨作用于WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞時，磷酸化p21的表達水平未見相似差異，見圖8、9。

圖8 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p21的活化水平Fig.8 p21 activation during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)cells and WR/FAS-SMS1

圖9 SN38單獨作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后p21的活化水平Fig.9 p21 activation during SN38 treatment of WR/FASSM(-)and WR/FAS-SMS1

圖10 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后caspase-3的活化水平Fig.10 Activation of caspase-3 during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FASSMS1

圖11 SN38和CH11共同作用WR/FAS-SM(-)和WR/FAS-SMS1后caspase-8的活化水平Fig.11 Activation of caspase-8 during SN38 and CH11 treatment of WR/FAS-SM(-)and WR/FASSMS1

2.5 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞caspase-3活化水平的觀察 caspase-3的活化水平在WR/FAS-SMS1細胞被SN38和CH11共同作用后的3小時升高，而在WR/FAS-SM(-)細胞中，沒有見到cleaved caspase-3表達水平的升高，見圖10。

2.6 SN38和CH11共同作用對WR/FAS-SM(-)細胞和WR/FAS-SMS1細胞caspase-8活化水平的觀察 經過SN38和CH11的共同作用，cleaved caspase-8的表達水平在 WR/FAS-SMS1細胞和WR/FAS-SM(-)細胞中都有所升高，并且在共同作用0.5、1、3小時的時間點上，兩細胞 cleaved caspase-8的表達水平存在顯著性差異，見圖11。

3 討論

DNA損傷阻滯包括四類因子，分別為感受因子、傳導因子、調節(jié)因子和效應因子。毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白(Ataxia telangiectasia mutated，ATM)是感受細胞DNA損傷的感受因子之一［8-10］，能夠感受雙鏈DNA片段以及染色質結構的改變，使細胞周期阻滯在G1、S、G2期［11］。ATM活化后可以活化其下游的一些分子，如p53、Chk以及Brca1和 SMC1等。Chk1是一種絲氨酸/蘇氨酸相關蛋白，可以在短期內減慢DNA合成的速度，阻滯細胞的分裂。抑癌基因p53及其下游的效應分子p21也參與Chk1介導的細胞周期阻滯過程。一些研究結果表明Chk1可被伊立替康誘導活化，導致細胞周期的阻滯［12，13］。Wang 和 Takeba［14，15］分別報道了伊立替康能使p53轉錄活性增加和SN38能夠增高Huh7細胞中p53分子的表達水平。本實驗中，Chk1和p53活化水平的檢測結果與上述報道相似。WR/FAS-SMS1細胞p53的活化強度高于WR/FAS-SM(-)細胞，而前期的研究結果也顯示WR/FAS-SMS1細胞的凋亡率明顯高于WR/FAS-SM(-)細胞?；诖私Y果我們推測，在CH11和SN38的共同作用下，p53的活化誘導了更強的細胞凋亡。p21是p53下游的一個重要靶點，而這只是反映了兩者活化順序的先后。p53能夠在轉錄水平活化p21，使細胞暫時停滯在G1和G2期，終止DNA復制和細胞分裂，給細胞以充分的時間進行修復［16］。目前研究表明p53的活化既能促進p21的活化，也能抑制p21的活化［17］，本研究結果則證實了后者。本研究結果表明，聯(lián)合應用SN38和CH11與單獨應用SN38相比，WR/FAS-SMS1細胞的凋亡是由p21磷酸化減弱引起的，正是由于p21沒有得到有效的活化才使細胞周期不能發(fā)生停滯，而使細胞沒有時間進行修復從而進入凋亡程序。本實驗結果同時提示，在腫瘤細胞對化療藥物的敏感性中，p21可能是一個重要的影響因素，抑制p21的活化將可能成為腫瘤治療的一個潛在靶點，脂筏可能通過調控p21的不同活化狀態(tài)最終導致了兩種細胞間凋亡率的差異。

caspase-8的活化是caspase級聯(lián)反應的第一步，其活化后可以活化下游的 caspase-3，6，7。caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應的下游，是介導凋亡的重要效應分子。本研究中 WR/FAS-SMS1細胞caspase-8和caspase-3的活化水平強于WR/FAS-SM(-)細胞，說明WR/FAS-SMS1細胞發(fā)生了更強的凋亡過程。這正是由于其DNA受損后活化了ATMChk1-p53途徑，但卻抑制了p21的活化，從而細胞周期沒有阻滯，使細胞進入了凋亡程序，才啟動了caspase-8和caspase-3的活化。有研究報道，脂筏對于配受體介導的信號功能非常重要，它參與TCR介導的信號轉導和Fas介導的細胞死亡［18，19］。鞘磷脂是細胞膜上脂筏重要的組成成分，前期研究已經表明，鞘磷脂能夠增加DISC形成，介導更強的凋亡［5］。本實驗中的兩株細胞正是由于膜表面鞘磷脂的差異才產生了不同的凋亡結果和caspase-8、caspase-3的活化狀態(tài)。據文獻報道，caspase-8活化能引起鞘磷脂酶活化［20］，由此推測本實驗中caspase-8的活化也可能作用于WR/FAS-SMS1細胞鞘磷脂酶，從而使細胞表面的鞘磷脂合成增加，進而放大脂筏促進凋亡的過程，形成一個正反饋環(huán)路。

綜上，SN38和CH11共同作用 WR/FAS-SMS1細胞，誘導更強凋亡可能由于活化了細胞內ATMChk1-p53途徑，導致p21活化水平降低，從而活化了caspase-3，8。而作用于WR/FAS-SM(-)細胞時，相比單獨應用SN38或者CH11，沒有引起更明顯的凋亡，則由于Chk1-p53途徑的活化沒有降低p21活化水平，從而沒有誘導caspase-3，8分子明顯活化。同時也提示我們抑制p21的活化將可能成為腫瘤治療的一個潛在靶點。

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