HMGB1半胱氨酸殘基氧化還原狀態(tài)與其功能①

陳 巖 綜述 秦陽(yáng)華 沈 茜 審校 (第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海200433)

高遷移率族蛋白1(High Mobility Group box 1，HMGB1)是一種非組蛋白核蛋白，在許多疾病中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有越來(lái)越多的研究表明HMGB1蛋白第106位點(diǎn)上半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)與其功能特性密切相關(guān)。

1 HMGB1的結(jié)構(gòu)與功能

高遷移率蛋白(High Mobility Group，HMG)是一組非組蛋白核蛋白，廣泛表達(dá)于真核生物細(xì)胞中，早于20世紀(jì)60年代由細(xì)胞核中提純獲得，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展又分為幾大家族，高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)是HMG超家族中的一員。

HMGB1是一種在大多數(shù)真核細(xì)胞中表達(dá)豐富(106分子/細(xì)胞)、高度保守的非組蛋白核蛋白，由215個(gè)氨基酸組成。哺乳動(dòng)物的HMGB1有98.5%氨基酸序列具有同源性，在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮著不同功能。近來(lái)許多實(shí)驗(yàn)表明其23、45和106位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基，尤其是106位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)對(duì)HMGB1的功能有重要影響。HMGB1包含兩個(gè)帶正電的DNA結(jié)合域:A盒與B盒和一個(gè)帶負(fù)電的酸性羧基端(圖1)［1］。

HMGB1是由215個(gè)氨基酸殘基組成的25 kD的蛋白質(zhì)，其中超過(guò)20%為賴氨酸，由3個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成，分別為兩個(gè)負(fù)電的DNA結(jié)合域(A盒，B盒)，一個(gè)帶正電的羧基端(由30個(gè)谷氨酸和天門冬氨酸組成)，其中A-box位于N末端，進(jìn)化高度保守;C-tail在羧基末端，包含30個(gè)重復(fù)的天冬氨酸和谷氨酸殘基，可參與調(diào)節(jié)HMGB1與DNA結(jié)合的親和力，B-box位于兩者之間。A-box和B-box均由3個(gè)螺旋組成，并帶有強(qiáng)烈的正電荷，構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合域。HMGB1釋放至胞外后主要由B-box發(fā)揮促炎功能，A-box對(duì)B-box有拮抗作用，而B-box中的106位點(diǎn)在HMGB1發(fā)揮促炎作用時(shí)起了重要作用，當(dāng)106位點(diǎn)被氧化HMGB1就喪失了促炎活性。

HMGB1是一種具有雙功能的警報(bào)蛋白，可以啟動(dòng)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，參與多種疾病過(guò)程。然而，其功能尚未完全明確;研究者發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)和在細(xì)胞外HMGB1發(fā)揮著不同的生物學(xué)效應(yīng)。在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1的DNA結(jié)合域與DNA的雙螺旋小溝結(jié)合引起了DNA的構(gòu)象變化，并參與DNA的轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、復(fù)制及核小體的穩(wěn)定;一旦釋放到細(xì)胞外，就會(huì)作為細(xì)胞因子激活炎癥細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1 和 IL-8 等［2］;從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿的HMGB1參與了細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)［3］。較早的研究者認(rèn)為HMGB1的促炎活性是通過(guò)與高度糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advance glycation end products，RAGE)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，因RAGE基因缺陷的小鼠其巨噬細(xì)胞被HMGB1刺激產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)的能力大大下降。RAGE是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的HMGB1的受體，表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞［4］。通過(guò)RAGE刺激下游的Cdc42與Rac，HMGB1可以介導(dǎo)趨化作用、參與細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫細(xì)胞的分化、平滑肌細(xì)胞及免疫細(xì)胞的遷移［5-8］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的 HMGB1也是通過(guò)與RAGE的結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK和Racl，并通過(guò)激活細(xì)胞外ERK、JNK、AKT等信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤的血管形成的［9］。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn)HMGB1的促炎活性主要是與 Toll樣受體(TLR)4有關(guān)。Yang等［10］用TLR2、TLR4基因缺陷小鼠和正常小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞經(jīng)HMGB1刺激后，發(fā)現(xiàn)TLR4缺陷的巨噬細(xì)胞不能產(chǎn)生TNF-α，IL-1β和IL-6的產(chǎn)生也大大下降，說(shuō)明TLR4在HMGB1促免疫細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子中是必需的。除了參與促炎細(xì)胞因子的釋放外，HMGB1與樹突狀細(xì)胞表達(dá)的TLR4結(jié)合在腫瘤的放、化療后抗腫瘤免疫反應(yīng)中起積極作用，TLR4基因突變的乳腺癌病人放療、化療后腫瘤復(fù)發(fā)的速度較 TLR4基因功能正常的病人快［11］。當(dāng)HMGB1與寡核苷酸結(jié)合形成復(fù)合物后就能與另外一個(gè)受體TLR9交互作用，在肝臟缺血再灌注損傷中產(chǎn)生病理?yè)p傷效應(yīng)［12］。有研究表明HMGB1與一些促炎細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6)和細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS共孵育后產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)生成的促炎細(xì)胞因子濃度是 HMGB1單獨(dú)刺激產(chǎn)生的 10倍［13］。Qin等［14］發(fā)現(xiàn)用HMGB1增強(qiáng)了LPS刺激小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的能力，但這種結(jié)合是有選擇性的，原因尚未闡明。在一些炎癥疾病中HMGB1的釋放促進(jìn)促炎細(xì)胞釋放更多的促炎細(xì)胞因子，這些促炎細(xì)胞因子又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的釋放，產(chǎn)生正反饋循環(huán)加劇了疾病的發(fā)生和發(fā)展。

2 HMGB1的氧化還原狀態(tài)對(duì)其功能的影響

HMGB1的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示23和45位的半胱氨酸殘基在空間上是反向的，且暴露在分子表面易于受氧化劑的影響形成交聯(lián)的二硫鍵，而106位點(diǎn)隱藏于HMGB1 L型溝槽內(nèi)，不參與HMGB1氧化還原依賴的構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，外環(huán)境氧化還原狀態(tài)的改變會(huì)影響HMGB1的空間構(gòu)象從而影響了HMGB1的功能。

還原狀態(tài)時(shí)的HMGB1三個(gè)位點(diǎn)上的殘基均為還原狀態(tài)，在氧化條件下23和45位的半胱氨酸殘基交聯(lián)形成二硫鍵，106位點(diǎn)亦被氧化，此時(shí)的HMGB1喪失了免疫活性。然而，在輕微的氧化環(huán)境中雖然23和45位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基被氧化，106位點(diǎn)上的半胱氨酸卻仍處于還原狀態(tài)時(shí)可以刺激炎癥的發(fā)生。Hoppe等［15］利用定點(diǎn)突變技術(shù)將HMGB1氨基酸序列的23、45和106位點(diǎn)單獨(dú)或聯(lián)合突變?yōu)榻z氨酸，破壞了二硫鍵的形成。突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)23、45單獨(dú)或聯(lián)合突變或三個(gè)位點(diǎn)均突變產(chǎn)生的HMGB1均為還原狀態(tài)，且單獨(dú)或聯(lián)合將23、45位點(diǎn)突變后并不影響HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)的分布，而106位點(diǎn)半胱氨酸殘基突變的HMGB1主要表達(dá)在胞漿。在此基礎(chǔ)上 Tang等［3］發(fā)現(xiàn)HMGB1 106位點(diǎn)半胱氨酸突變成亮氨酸后自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的量也增加了，由此可見106位點(diǎn)不僅對(duì)于HMGB1在胞漿到胞核之間的穿梭起重要作用，更參與了自噬的調(diào)節(jié)。106位點(diǎn)半胱氨酸殘基氧化還原狀態(tài)的改變不僅僅影響了HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布，106位上半胱氨酸替換成賴氨酸的重組HMGB1蛋白不能與TLR4/MD2結(jié)合，不能介導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。為了進(jìn)一步確認(rèn)此位點(diǎn)在這一過(guò)程中的重要性，人工合成了包含B盒前20個(gè)氨基酸的肽段(89～108位點(diǎn)，TLR4結(jié)合位點(diǎn))，其106位點(diǎn)上的半胱氨酸替換成絲氨酸后，這一肽段也不能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α［10］。先前的研究者認(rèn)為凋亡細(xì)胞產(chǎn)生HMGB1的量較少、且與DNA結(jié)合較緊密，故不能激活免疫系統(tǒng)。Urbonaviciute等［16］在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞死亡過(guò)程中HMGB1半胱氨酸殘基經(jīng)歷了可逆的氧化修飾，從而喪失了免疫活性。將3種不同位置突變的重組HMGB1加入與凋亡細(xì)胞共孵育的樹突狀細(xì)胞、再加入氧化劑H2O2后發(fā)現(xiàn):106位點(diǎn)突變后的HMGB1能夠阻止由凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫耐受的產(chǎn)生，維持了免疫原性［17］。總之，HMGB1通過(guò) TLR4誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的過(guò)程中，106位點(diǎn)上的半胱氨酸扮演了重要角色。

圖1 HMGB1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of human HMGB1

3 HMGB1的氧化還原狀態(tài)與自噬

自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)復(fù)雜的過(guò)程，在細(xì)胞受到損傷時(shí)從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬所起的作用是正面還是負(fù)面的，尚未完全闡明。Tang等［18］對(duì)HMGB1進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)HMGB1的釋放在細(xì)胞的凋亡與自噬的發(fā)生中起到了交叉調(diào)節(jié)的作用，決定了細(xì)胞死亡或生存。這個(gè)概念延伸到抗腫瘤治療時(shí)HMGB1既可以參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、遷移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展;又可以通過(guò)TLR誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化，發(fā)揮抗腫瘤的作用。在腫瘤的放射治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞釋放的大量活性氧(ROS)氧化了HMGB1的半胱氨酸殘基，使HMGB1喪失了免疫活性，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤抗原免疫耐受的形成。放射治療和一些細(xì)胞毒藥物在刺激腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)也使細(xì)胞產(chǎn)生了自噬，Liu等［19］發(fā)現(xiàn)在白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞中加入外源性HMGB1后自噬增加了，也降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，這種類似于“棄車保帥”的行為使腫瘤細(xì)胞逃避藥物的作用。同時(shí)HMGB1大量釋放又促進(jìn)自噬的發(fā)生，該作用充當(dāng)了促細(xì)胞存活信號(hào)的角色，降低了抗腫瘤治療的效果。對(duì)于自噬通路的研究，Kang等［20］發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)的HMGB1與Bcl-2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bcline-1，在調(diào)節(jié)自噬溶酶體形成過(guò)程中起到了重要作用。然而釋放到細(xì)胞外的HMGB1在調(diào)節(jié)自噬的產(chǎn)生時(shí)受自身氧化還原狀態(tài)的影響，其中106位點(diǎn)狀態(tài)不同的HMGB1在抗腫瘤治療過(guò)程中所起作用亦不同。Tang等［18］使用兩種不同狀態(tài)的 HMGB1(23和45位點(diǎn)半胱氨酸殘基交聯(lián)成二硫鍵，只在106位點(diǎn)氧化還原狀態(tài)不同)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):在人結(jié)腸癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中使用還原型 HMGB1，可通過(guò)與RAGE結(jié)合促發(fā)了Bcline-1依賴的自噬，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的抵抗;而氧化型HMGB1則增加了這些藥物的細(xì)胞毒性及與此引發(fā)的caspase-9/-3通路介導(dǎo)的凋亡。這些現(xiàn)象讓我們思考能否有種方法使 HMGB1能夠保持免疫活性，Kazama等［17］利用定點(diǎn)突變技術(shù)將易被氧化的第23、45、106位點(diǎn)半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，此突變體不會(huì)被細(xì)胞間氧氧化，既保留了免疫原性又可激活樹突狀細(xì)胞引起T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。我們認(rèn)為可以將HMGB1的這一特性、結(jié)合傳統(tǒng)的治療方法，可能為腫瘤的治療找到一個(gè)新靶點(diǎn)。

4 展望

雖然抗HMGB1治療在許多疾病中都取得了不錯(cuò)的效果，但是HMGB1釋放抑制劑不能產(chǎn)生特異性效果，而抗HMGB1抗體在應(yīng)用于人體時(shí)需人源化，否則會(huì)產(chǎn)生人抗異源性抗體反應(yīng)。同時(shí)，在腫瘤治療過(guò)程中HMGB1的不同狀態(tài)也會(huì)產(chǎn)生不同的效果。鑒于此，我們認(rèn)為可以通過(guò)制備HMGB1的突變體，在炎癥反應(yīng)時(shí)此突變體會(huì)與受體結(jié)合，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性HMGB1與受體的結(jié)合、而不產(chǎn)生炎癥效應(yīng)，又不影響其他分子的作用。在腫瘤治療過(guò)程中，制備的突變體可以避免HMGB1重要位點(diǎn)的氧化，保持其免疫活性，提高治療效果和特異性。

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