響應(yīng)面法優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

宇光海，尹艷麗，張 垚

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院生物工程系,河南 鄭州 450001)

達(dá)托霉素(DAP)屬于A21978C家族，是一種含有13個(gè)氨基酸的大環(huán)脂肽類抗生素，在玫瑰孢鏈霉菌中以非核糖體蛋白合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)機(jī)制合成，具有依賴于Ca2+破壞病菌細(xì)胞膜的新型作用，因此對(duì)許多耐藥病菌具有顯著的治療作用[1～4]。達(dá)托霉素具有在體外抗絕大多數(shù)臨床革蘭氏陽(yáng)性菌的作用，對(duì)于一些可選擇的抗生素很少的耐藥菌，如耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、糖肽類敏感的金黃色葡萄球菌(GISA)、凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)等的感染具有有效的殺菌和抑菌效果[5]。達(dá)托霉素2003年被FDA批準(zhǔn)用來(lái)治療由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染,2006年被FDA批準(zhǔn)用來(lái)治療由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的菌血癥和由耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側(cè)心內(nèi)膜炎[5]。因此，達(dá)托霉素已成為21世紀(jì)最具潛力和應(yīng)用價(jià)值的抗生素之一，其醫(yī)學(xué)價(jià)值、社會(huì)影響力與日俱增，市場(chǎng)前景廣闊。但仍存在產(chǎn)量低、成本高的問(wèn)題。因此，提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量迫在眉睫。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對(duì)于目的產(chǎn)物的形成有著顯著的影響。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可以顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量[6，7]。近年來(lái)培養(yǎng)基優(yōu)化方法已經(jīng)由傳統(tǒng)的耗時(shí)耗力的非統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法逐漸發(fā)展為統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法，其中最為常用的是Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法。Plackett-Burman 設(shè)計(jì)從多種因素中篩選出主要影響因子[8]，最陡爬坡設(shè)計(jì)使主要因子的水平接近響應(yīng)面最大值，響應(yīng)面設(shè)計(jì)最后確定因素的最優(yōu)值[9]。該優(yōu)化方法已廣泛應(yīng)用于工程設(shè)計(jì)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，并取得了良好的效果[10]。

作者在此采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法對(duì)達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)品，大連美倫生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純。

1200型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)GC-68是StreptomycesroseosporusNRRL11379的自然篩選突變株，自行保藏。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基(斜面固體培養(yǎng)基，g·L-1)：可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂粉 20，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g·L-1):可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖 7.5，糊精 10，可溶性淀粉 10，蛋白胨 8.5，酵母浸粉 6，干酪素 8.5，L-天冬氨酸 1，谷氨酸 0.5，MgSO40.5，K2SO40.5，K2HPO40.5，pH值7.2～7.4。

1.3 方法

將分離后的菌株接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，于30 ℃、濕度40%的條件下培養(yǎng)7 d；將斜面種子接種于已滅菌的種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h左右；取1 mL種子培養(yǎng)液接種于設(shè)計(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r·min-1搖床發(fā)酵7 d(48 h時(shí)加入0.2 g·L-1正癸酸)，測(cè)定菌體生長(zhǎng)量和達(dá)托霉素產(chǎn)量，以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。

1.4 分析與檢測(cè)

菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定采用干重法[11]。

達(dá)托霉素產(chǎn)量的測(cè)定采用HPLC法[11]：分析柱為反相ODS柱，流動(dòng)相為含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(45.5∶54.5，體積比)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，柱壓8～9 MPa，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Design expert 7.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，并結(jié)合玫瑰孢鏈霉菌菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵的特點(diǎn)，選取11個(gè)因素(包括不同的碳源、氮源和微量元素)，根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基成分分別選擇一個(gè)高水平、一個(gè)低水平，進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考察培養(yǎng)基中的11個(gè)因素對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果/g·L-1

對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，除變量C、D、G的Prob>F值小于0.05外，其它變量的Prob>F值均大于0.05。說(shuō)明在Plackett-Burman設(shè)計(jì)中，變量C、D、G顯著，而其它變量不顯著[12]。表明變量C、D、G的模型貢獻(xiàn)率較大，是構(gòu)建模型的主要影響因素。運(yùn)用Design expert 7.0軟件對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于響應(yīng)面的多元一次方程：DAP=233.17778+0.53333A-1.39167B-9.56000C-5.35333D-2.30000E+7.35556F-28.00000G，作為主要影響因素的變量C、D、G在多元一次方程中的系數(shù)都為負(fù)值，表明它們?cè)谀Ｐ椭械挠绊懢鶠樨?fù)效應(yīng)，在后續(xù)的最陡爬坡設(shè)計(jì)中均需降低這些因素的實(shí)際濃度水平。

2.2 最陡爬坡設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman設(shè)計(jì)得到的多元一次方程的基礎(chǔ)上，根據(jù)其系數(shù)的正負(fù)及大小，設(shè)計(jì)主要因素C、D、G的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，選擇合適的上升路徑和步長(zhǎng)，得出峰值，從而逼近其最大響應(yīng)區(qū)域，為下一步的響應(yīng)面設(shè)計(jì)做準(zhǔn)備[12]。其它次要因素均依照其在方程中系數(shù)的正負(fù)分別取Plackett-Burman設(shè)計(jì)編碼值的高水平或低水平。最陡爬坡設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，3#實(shí)驗(yàn)的達(dá)托霉素產(chǎn)量最高，達(dá)176.85 mg·L-1。故以3#實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配方作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方差分析

表3 最陡爬坡設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

以最陡爬坡設(shè)計(jì)得到的培養(yǎng)基配方為中心點(diǎn)，運(yùn)用Design expert 7.0軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)，針對(duì)主要因素C、D、G的濃度使用中值組合重新編碼，以達(dá)托霉素的產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[13]，其因素與水平見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素與水平

糊精、可溶性淀粉和L-天冬氨酸的濃度水平如表4所示，其它次要因素均取最低水平，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用Design expert 7.0軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的回歸方程分析和方差分析

R2=0.9636，R2(adj)=0.9267

由表6可知，模型Prob>F值小于0.001,說(shuō)明模型極為顯著；變量A′、B′的Prob>F值小于0.001，極為顯著；變量C′顯著(Prob>F值小于0.05)；交互項(xiàng)A′C′極為顯著(Prob>F值小于0.01)；虛擬變量不顯著。說(shuō)明此模型選擇較為合理，分析結(jié)果較為可靠。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9636,說(shuō)明96.36%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可由回歸方程解釋，因此可用模型代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；貧w使用3-D Surface繪制響應(yīng)面三維曲線，如圖1所示。

圖1 各因素交互作用響應(yīng)面圖

由圖1可知，此響應(yīng)面的最高點(diǎn)在設(shè)計(jì)的模型范圍之內(nèi)，說(shuō)明此響應(yīng)面的變量設(shè)計(jì)較好，可以進(jìn)行后續(xù)分析以求得響應(yīng)值最高點(diǎn)。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸，得到響應(yīng)值擬合方程：DAP=180.20+0.037A′-1.63B′-1.76C′+5.03A′B′+1.05A′C′+2.98B′C′+2.20A′2-2.77B′2-0.45C′2，R2=0.9428。

利用軟件的Numerical optimization 功能預(yù)測(cè)響應(yīng)值最大值，模型各因素的組合為糊精7.0 g·L-1、可溶性淀粉6.66 g·L-1、L-天冬氨酸0.4 g·L-1,達(dá)托霉素最大產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為186.0 mg·L-1。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證Design expert 7.0軟件分析和預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，以預(yù)測(cè)響應(yīng)值的最大值所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基組成為配方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 優(yōu)化前后菌體生長(zhǎng)及達(dá)托霉素產(chǎn)量

由圖2可知，優(yōu)化前后，培養(yǎng)基中各組分含量的變化對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響不太顯著,但優(yōu)化后穩(wěn)定期菌體的干重明顯升高。穩(wěn)定期是達(dá)托霉素的主要合成時(shí)期，高的菌體濃度有利于達(dá)托霉素的合成，因此，由圖中曲線可以看到，培養(yǎng)基優(yōu)化后，達(dá)托霉素的產(chǎn)量顯著上升，由優(yōu)化前的106.7 mg·L-1最高可升到185.3 mg·L-1，提高了73.7%。這可能是由于，優(yōu)化后的培養(yǎng)基使達(dá)托霉素合成和菌體生長(zhǎng)有更好的平衡關(guān)系，使底物抑制作用降低，同時(shí)可以更好地為達(dá)托霉素的合成提供前體物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法，使用Design expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到了達(dá)托霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基中糊精、可溶性淀粉、L-天冬氨酸的濃度分別為7.0 g·L-1、6.66 g·L-1、0.4 g·L-1，在此條件下，達(dá)托霉素的產(chǎn)量達(dá)到185.3 mg·L-1，比優(yōu)化前的106.7 mg·L-1提高了73.7%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Canepari P，Boaretti M，Lleó M M，et al.Lipoteichoic acid as a new target for activity of antibiotics：Mode of action of daptomycin(LY146032)[J].Antimicrob Agents Chemother，1990，34(6)：1220-1226.

[2] Enoch D A，Bygott J M，Daly M L，et al.Daptomycin[J].J Infect，2007，55(3)：205-213.

[3] Jeu L，F(xiàn)ung H B.Daptomycin：A cyclic lipopeptide antimicrobial agent[J].Clin Ther，2004，26(11)：1728-1757.

[4] Walsh C T，F(xiàn)ischbach M A.Natural products version 2.0：Connecting genes to molecules[J].J Am Chem Soc，2010，132(8)：2469-2493.

[5] Sauermann R，Rothenburger M，Graninger W，et al.Daptomycin: A review 4 years after first approval[J].Pharmacology,2008，81(2)：79-91.

[6] Tanyildizi M S，Ozer D,Elibol M.Optimization ofα-amylase production byBacillussp.using response surface methodology[J].Process Biochem，2005，40(7):2291-2296.

[7] Tari C，Genckal H，Tokatli F.Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolatedBacillussp.L21[J].Process Biochem，2006，41(3)：659-665.

[8] Miller A，Sitter R R.Using the folded-over 12-run Plackett-Burman design to consider interactions[J].Technometrics，2001，43(1)：44-54.

[9] Myers R H.Response surface methodology：Current status and future directions[J].J Qual Technol，1999，31(1):30-44.

[10] Bezerra M A，Santelli R E，Oliveira E P，et al.Response surface methodology(RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta，2008，76(5)：965-977.

[11] 盧文玉，聞建平，范晶華，等.癸酸抗性突變株流加發(fā)酵法生產(chǎn)達(dá)托霉素[J].天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，39(B06)：20-24.

[12] Chen Xiao-Chun，Bai Jian-Xin，Cao Jia-Ming，et al.Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3′，5′-monophosphate byMicrobacteriumsp.no.205 using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2009，100(2)：919-924.

[13] Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production byCandidacylindraceausing two different carbon sources[J].Biochem Eng，2001，9(1):17-23.