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    內(nèi)源性中葉素可減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大

    2012-07-28 09:57:42楊靖輝馬存根齊永芬唐朝樞
    中國藥理學(xué)通報(bào) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:乳鼠孵育心肌細(xì)胞

    楊靖輝,馬存根,齊永芬,唐朝樞

    (1.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所,山西大同 037009;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理系,北京 100083)

    多種疾病狀態(tài)下,心臟局部中葉素(IMD)的生成、表達(dá)會發(fā)生明顯改變。文獻(xiàn)報(bào)道,自發(fā)性高血壓大鼠及腎性高血壓大鼠心臟IMD基因表達(dá)增加[1-2],而離體缺血/再灌注損傷大鼠心臟組織IMD生成則明顯減少[3]。上述結(jié)果提示IMD作為一種重要的旁/自分泌因子參與了疾病狀態(tài)下心臟功能的調(diào)節(jié)。心肌肥厚是多種心血管疾病的一種后期病理改變,以心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)成分改變?yōu)橹鞯男呐K重塑是心肌肥厚的主要表現(xiàn)形式。在體實(shí)驗(yàn)顯示,肥厚的大鼠心臟 IMD 表達(dá)增加[4-5],但在心肌細(xì)胞IMD生成表達(dá)是否也具有類似的變化,文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。

    本試驗(yàn)以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞構(gòu)建肥大模型,觀察心肌細(xì)胞肥大過程中IMD及其受體系統(tǒng)生成表達(dá)的變化,并探討內(nèi)源性IMD在心肌肥大過程中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 新生Wistar大鼠(1~3 d)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠AngⅡ、IMD1-53、CGRP8-37、ADM22-52、兔抗大鼠IMD抗血清及放射免疫測定試劑盒由Phoenix Pharmaceutical Inc(USA)提供。[3H]-Leu、PVDF膜、ECL試劑盒購自Amersham Life Science(England),總RNA提取試劑盒購自Gibco-BRL(Grand Island,NY),反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Gibco-BRL,Life Technologies,Inc(Gaithersburg,MD),Real time PCR反應(yīng)引物購自北京奧科公司。余為市售分析純產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生Wistar鼠心臟,去除心房及血管后剪碎心室,以1 mmol·L-1胰酶37℃消化成細(xì)胞懸液,過濾,2 000×g離心10 min,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸浮,差速貼壁90 min后取上清,將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2條件下密閉培養(yǎng)。48 h后換無血清DMEM,培養(yǎng)24 h后將乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為:① 對照組;② AngⅡ(10-7mol·L-1)孵育組;③AngⅡ +IMD(10-7mol·L-1)組;④ AngⅡ +IMD抗血清(1∶100)組;⑤ AngⅡ+IMD受體阻斷劑組(ADM22-52 或 CGRP8-37,均為 10-6mol·L-1)組。所有試驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)鑒定95%以上為心肌細(xì)胞,95%以上為活細(xì)胞。

    1.2.2 [3H]-Leu攝入測定 無血清培養(yǎng)24 h后的乳鼠心肌細(xì)胞加入不同干預(yù)藥物,孵育12 h后,分別加入[3H]-Leu(37 kBq·L-1)繼續(xù)孵育24 h,冷PBS液終止反應(yīng),并洗兩遍,細(xì)胞以10%三氯醋酸4℃孵育20 min,再經(jīng)95%乙醇沖洗。收集細(xì)胞,以0.5 mol·L-1NaOH融解2 h后加入閃爍液,于β液閃儀上測量[3H]放射活性,以cpm/105細(xì)胞表示[3H]-Leu的攝入率。

    1.2.3 Real time PCR 方法[6]測定乳鼠心肌細(xì)胞BNP、IMD、CRLR、RAMP 1、RAMP 2、RAMP 3 mRNA水平 無血清培養(yǎng)24 h后的乳鼠心肌細(xì)胞加入不同干預(yù)藥物,孵育12 h后,用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real time PCR反應(yīng)總體積為 20 μl,其中包括定量 PCR 預(yù)混合液 10 μl、前向引物和反向引物(20 mmol·L-1)各 1.8 μl、Probe 0.5 μl、產(chǎn)物 cDNA 0.5 μl、其余用無 RNase 水補(bǔ)足。反應(yīng)條件:95℃ 5 min;95℃ 30 s;57℃ 30 s;72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。測定各模板Ct值,通過Ct值以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行相對定量。相關(guān)引物和熒光探針列于Tab 1。

    1.2.4 放射免疫法測定IMD含量 收集對照組及AngⅡ孵育12 h后的上清液加入0.5 ml的0.1 mol·L-1醋酸,煮沸10 min,10 000 ×g 離心 15 min,取上清液參照IMD放免試劑盒說明書測定IMD含量,并以 μg·L-1表示。

    1.2.5 Western blot分析法 無血清培養(yǎng)24 h后的乳鼠心肌細(xì)胞分為對照組和AngⅡ孵育組,培養(yǎng)12 h后收集蛋白,取樣本總蛋白30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離膠濃度為12%,之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在含5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液中,封閉1 h。漂洗后PVDF膜與兔抗大鼠IMD抗體(1∶200)4℃孵育過夜,經(jīng)漂洗再與羊抗兔IgG二抗(1∶500)室溫孵育1 h,ECL顯色,結(jié)果以β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。

    Tab 1 Primers and fluorescent probes

    2 結(jié)果

    2.1 AngⅡ?qū)θ槭笮募〖?xì)胞IMD及其受體系統(tǒng)基因表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示AngⅡ(10-7mol·L-1)孵育 12 h后乳鼠心肌細(xì)胞 IMD mRNA表達(dá)較對照組降低46%,RAMP 1,RAMP 3 mRNA表達(dá)較對照組分別增強(qiáng)49%和135%(均P<0.01),CRLR及RAMP 2 mRNA表達(dá)較對照組無差異(Fig 1)。

    2.2 AngⅡ抑制乳鼠心肌細(xì)胞IMD產(chǎn)生和分泌Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比AngⅡ孵育可降低心肌細(xì)胞IMD蛋白表達(dá)。同時(shí),放射免疫分析結(jié)果顯示,AngⅡ孵育組較對照組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IMD含量明顯降低(6.66±0.65 vs 10.62±0.92 μg·L-1)(均 P <0.01,F(xiàn)ig 2)。

    2.3 IMD及其抗血清對AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響 本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞內(nèi)蛋白合成增加及BNP mRNA表達(dá)增強(qiáng)作為心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)。以[3H]-Leu參入方法檢測乳鼠心肌細(xì)胞蛋白合成的變化,以Real-time PCR方法檢測乳鼠心肌細(xì)胞BNP mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示,AngⅡ(10-7mol·L-1)孵育使乳鼠心肌細(xì)胞[3H]-Leu攝入較對照組增加104%(2529±123 vs 1240±53 cpm/105cells,P <0.01,F(xiàn)ig 3A)。同時(shí),BNP mRNA表達(dá)較對照組增加197%(P<0.01,F(xiàn)ig 3B)。外源性給以IMD活性片段 IMD1-53(10-7mol·L-1)可明顯抑制 AngⅡ所誘導(dǎo)的[3H]-Leu攝入及BNP mRNA表達(dá)增加(P<0.01)(Fig 3A,B)。

    Fig 1 Effects of AngⅡon IMD and its receptor system components mRNA expressions in neonatal cardiomyocytes(±s,n=3)

    單獨(dú)給以正常兔血清或兔抗大鼠IMD抗血清(1∶100)對靜止的心肌細(xì)胞[3H]-Leu參入及BNP mRNA表達(dá)均無明顯影響,但以IMD抗血清預(yù)孵育可使乳鼠心肌細(xì)胞[3H]-Leu參入量較AngⅡ單獨(dú)作用組增加69%(P<0.01,F(xiàn)ig 3A),BNP mRNA表達(dá)較 AngⅡ單獨(dú)作用組增加61%(P<0.01,F(xiàn)ig 3B)。而正常兔血清預(yù)孵育則無上述作用。

    2.4 IMD受體阻斷劑對AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響 單獨(dú)給以IMD受體阻斷劑ADM22-52或CGRP8-37,二者對靜止心肌細(xì)胞的[3H]-Leu參入及BNP mRNA表達(dá)均無明顯影響,如果以受體阻斷劑預(yù)孵育20 min后再給以AngⅡ刺激,ADM22-52和CGRP8-37可使乳鼠心肌細(xì)胞[3H]-Leu參入量較AngⅡ單獨(dú)作用組分別增加46%和38%(均P<0.01,F(xiàn)ig 4A),BNP mRNA 表達(dá)較 AngⅡ單獨(dú)作用組分別增加44%和45%(均P<0.01,F(xiàn)ig 4B)。

    3 討論

    心肌肥大是高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥,持續(xù)性心肌肥大最終可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病、心衰和猝死[7]。同時(shí),心臟具有重要的內(nèi)分泌功能,能合成和分泌多種循環(huán)激素和旁/自分泌物質(zhì),參與循環(huán)系統(tǒng)的功能、代謝和結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。其中IMD是心臟旁/自分泌的重要物質(zhì)之一[8-9]。但在離體培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)胞上IMD及其受體系統(tǒng)生成、表達(dá)的變化目前尚未見報(bào)道。本工作應(yīng)用促肥大因子AngⅡ孵育乳鼠心肌細(xì)胞構(gòu)建肥大模型,觀察肥大發(fā)生過程中,心肌細(xì)胞IMD及其受體系統(tǒng)生成、表達(dá)的變化。

    Fig 2 AngⅡinhibits the production and secretion of IMD in neonatal cardiomyocytes(±s,n=6)

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,AngⅡ孵育乳鼠心肌細(xì)胞可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞肥大的發(fā)生,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞[3H]-Leu攝入及BNPmRNA表達(dá)增加。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。進(jìn)一步檢測肥大心肌細(xì)胞IMD及其受體系統(tǒng)生成、表達(dá)的變化。結(jié)果顯示,肥大的心肌細(xì)胞IMD產(chǎn)生、分泌及基因表達(dá)均明顯降低。與此不同的是,有文獻(xiàn)報(bào)道,在自發(fā)性高血壓大鼠和一氧化氮缺乏大鼠肥大的左心室組織,IMD基因表達(dá)明顯增加[4-5]。上述差異可能是由于心臟組織中,除心肌細(xì)胞外,成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均可生成表達(dá)IMD,病理狀態(tài)下,各種細(xì)胞IMD的生成、表達(dá)可受到不同形式的調(diào)節(jié)。因此,在完整心臟與單純心肌細(xì)胞上IMD生成、表達(dá)則出現(xiàn)不同。

    Fig 3 Effects of IMD and prepro-IMD antiserum on AngⅡ-induced myocyte hypertrophic response(±s,n=6)

    此外,實(shí)驗(yàn)還證實(shí),在肥大的心肌細(xì)胞RAMP 1、RAMP 3 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),但CRLR及RAMP 2 mRNA表達(dá)無明顯變化。CRLR/RAMPs受體系統(tǒng)是CGRP超家族共同的受體系統(tǒng)。已知RAMPs具有3種亞型RAMP 1、RAMP 2和RAMP 3。不同的RAMP與CRLR結(jié)合表現(xiàn)為對不同配體具有親和的,不同的受體表型,從而決定了配體的生物學(xué)效應(yīng)。例如,CRLR與RAMP 1共同作用表現(xiàn)為CGRP受體表型,CRLR與 RAMP 2,3共同作用表現(xiàn)為ADM受體表型。而Roh等[11]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)IMD可作為CRLR/RAMPs復(fù)合物的非選擇性配體。本實(shí)驗(yàn)中RAMP 1、RAMP 3基因表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)IMD在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。

    Fig 4 Effects of the antagonists of IMD receptor on AngⅡ-induced myocyte hypertrophic response(±s,n=6)

    實(shí)驗(yàn)還顯示,外源性給予IMD的活性片段IMD1-53可明顯抑制AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。此外,單獨(dú)給以IMD抗血清及IMD受體阻斷劑ADM22-52和 CGRP8-37,3者對靜止心肌細(xì)胞的[3H]-Leu參入及BNP mRNA表達(dá)均無明顯影響,但在給以IMD抗血清阻斷內(nèi)源性IMD的生物學(xué)效應(yīng),或以ADM22-52或CGRP8-37阻斷IMD受體后,再以肥大刺激劑AngⅡ共孵育,則可觀察到AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)明顯增強(qiáng)。

    上述結(jié)果證實(shí)IMD具有抗心肌細(xì)胞肥大作用,且內(nèi)源性IMD作為心臟重要的旁/自分泌因子,參與了心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展,并可能在其中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。對內(nèi)源性IMD及其受體系統(tǒng)生成、表達(dá)的干預(yù)是否可作為今后防治心肌細(xì)胞肥大新的作用途徑值得進(jìn)一步研究。

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