梓醇對大鼠梗死灶周圍大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹突生長及突觸素表達(dá)的影響

萬 東，?；埒P，羅 勇，謝 鵬

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，重慶 400016;2.西南大學(xué)藥學(xué)院暨中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400716;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

腦卒中后，受損神經(jīng)環(huán)路修復(fù)和重建奠定了神經(jīng)缺失功能恢復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。梗死灶周圍大腦皮質(zhì)(peri-infarction cortex，PIC)幸存神經(jīng)元樹突重塑、軸突再生和突觸重構(gòu)是神經(jīng)環(huán)路重建最關(guān)鍵的可塑性事件。迄今，神經(jīng)修復(fù)藥物極其匱乏，Ⅲ期臨床試驗中，僅發(fā)現(xiàn)胞磷膽堿對卒中后受累肢體功能恢復(fù)有促進(jìn)作用［1］。

梓醇是地黃主要的有效單體成分，具有確切的神經(jīng)保護(hù)作用［2］和促神經(jīng)修復(fù)潛能。課題組前期研究表明梓醇能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長［3］;上調(diào)缺血性腦卒中大鼠PIC區(qū)軸突生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)蛋白表達(dá)［4］，增加 PIC 區(qū)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目［5］，改善模型大鼠受累前肢感覺運(yùn)動功能［6］，提示梓醇可促進(jìn)卒中后軸突芽生和突觸重構(gòu)，有助于受損神經(jīng)環(huán)路信號輸出通道的修復(fù)重建。但梓醇能否誘導(dǎo)神經(jīng)元樹突生長，促進(jìn)神經(jīng)元信息接收通道和信號整合平臺的修復(fù)重建目前尚未見相關(guān)報道。因此，本研究制備大鼠局灶缺血性腦卒中模型，觀察梓醇對模型大鼠神經(jīng)缺失功能恢復(fù)、PIC區(qū)神經(jīng)元樹突樹復(fù)雜程度、樹突棘密度以及突觸素p38蛋白表達(dá)的影響，明確梓醇促腦卒中后神經(jīng)修復(fù)作用，探討其可能的神經(jīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年健康Sprague-Dawley大鼠57只，♀♂不拘，體質(zhì)量(220－250)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(合格證號:檢動字2002A040)。隨機(jī)分為7組:假手術(shù)組，模型組，生理鹽水組，梓醇低、中、高劑量組和胞磷膽堿對照組。

1.2 藥品和器材 梓醇購于中國藥品生物制品檢定所(產(chǎn)品批號:110808-200508，規(guī)格:20 mg/支)。胞磷膽堿鈉注射液為山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品(國藥準(zhǔn)字 H14021994，規(guī)格:125 g·L－1)。小鼠抗突觸素單克隆抗體、兔抗突觸素多克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、熒光素FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、AP標(biāo)記羊抗兔IgG以及BCIP/NBT顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。Koda顯影液和Koda定影液由重慶醫(yī)科大學(xué)校內(nèi)“世強(qiáng)像館”饋贈。Leica-cm1850型冰凍切片機(jī)、Leica VT1000S型振動切片機(jī)為日本島津公司產(chǎn)品，垂直電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)槽為Bio-Rad公司產(chǎn)品，圖像掃描采用Scan-Maker E6系統(tǒng)，圖像灰度測量采用4.5.1版Quantity one圖像分析軟件。

1.3 模型制備 參照文獻(xiàn)［4，6－7］，采用顳側(cè)低位開顱法電凝右側(cè)大腦中動脈位于嗅束與大腦下靜脈之間的一段，制備永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型。假手術(shù)組除不凝閉大腦中動脈外，其余操作同模型組。

1.4 模型成功的判斷與納入標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后24 h，采用Bederson評分［7］評估受累肢體神經(jīng)缺失功能狀況:0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分，左前肢屈曲，但不伴有其他異常，即提尾懸空實驗陽性;2分，提尾懸空實驗陽性，同時側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性)，但自由活動時無轉(zhuǎn)圈行為;3分，同2分行為，且自由活動時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈。評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 藥物干預(yù) 梓醇低、中、高劑量分別為1、5、10 mg·kg－1，胞磷膽堿給藥劑量為 0.5 g·kg－1。梓醇和胞磷膽堿均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3 ml。生理鹽水組經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水。假手術(shù)組和模型組不給任何藥物干預(yù)。于術(shù)后24 h首次經(jīng)腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)測試 參照文獻(xiàn)［8］，采用角落實驗于術(shù)前1 d測評各實驗組大鼠軀體轉(zhuǎn)向偏好，術(shù)后1 d(給藥前)、4、7和15 d評價感覺運(yùn)動整合功能和姿勢不對稱運(yùn)動。將兩塊大小為30 cm×20 cm×0.5 cm的硬紙板制作呈30°夾角的狹窄通道，兩塊紙板前端不完全接觸，保留0.5 cm的縫隙。行為評定時，將大鼠置于兩塊紙板中間的通道上，嘴側(cè)朝向角頂。將夾板從大鼠嘴側(cè)向尾側(cè)緩慢移動，使兩塊硬板同時觸及大鼠雙側(cè)的胡須。大鼠受到來自兩側(cè)的刺激后，會直立身體，向左或向右轉(zhuǎn)身。正常大鼠左轉(zhuǎn)身和右轉(zhuǎn)身次數(shù)基本相同;而腦卒中大鼠受肢體偏癱的影響，向病灶側(cè)(本研究為右側(cè))轉(zhuǎn)身的次數(shù)明顯增加。每次測評時每只鼠觀察10次，記錄右轉(zhuǎn)身次數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 腦梗死體積測定 參照課題組前期方法［9］，采用磁共振成像(MRI)檢測大鼠腦梗死體積。于pMCAO術(shù)后1 d(給藥前)和15 d時，采用TOSHIBA VISART 1.5T超導(dǎo)核磁共振成象儀，選用膝正交線圈(QD)，行頭顱T2WI掃描。測量各組大鼠腦梗死絕對體積占對側(cè)大腦半球體積的百分比，即相對腦梗死體積。

1.8 Golgi-Cox染色 依據(jù)文獻(xiàn)介紹［10］，配置Golgi-Cox溶液，避光靜置1 d后使用。術(shù)后15 d，假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、梓醇中劑量組和胞磷膽堿組各取3只大鼠，深麻醉后斷頭取腦，去除大腦額極部分，采用懸吊法將腦組織塊懸吊于100 ml Golgi-Cox溶液中，室溫避光靜置14 d后取出腦組織塊，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中浸糖2～5 d。采用振動切片機(jī)制備厚為100 μm的腦片，用Leica-cm1850型冰凍切片機(jī)制備厚度為60 μm的腦片。收集所有的腦片，采用飄浮法完成腦片顯影和定影。蒸餾水漂洗10 min后，裱片、干燥、常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.9 神經(jīng)元樹突形態(tài)學(xué)觀察分析 參照文獻(xiàn)方法［11］，制定用于圖像分析的神經(jīng)元入選標(biāo)準(zhǔn):(1)細(xì)胞定位明確，整體輪廓清晰，胞體和突起著色均勻一致;(2)單個神經(jīng)元的大部分樹突野清晰可辨，且聚焦在同一平面;(3)神經(jīng)元的樹突分支至少可以顯示到3級或以上;(4)所選神經(jīng)元不被其它神經(jīng)元胞體、突起或血管遮擋。

在200倍光鏡下觀察PIC區(qū)距梗死灶邊緣1.5～2.5 mm范圍內(nèi)大腦皮質(zhì)錐體神經(jīng)元樹突分支，1 000倍油鏡下觀察神經(jīng)元樹突棘。每只大鼠采集20個錐體神經(jīng)元的樹突像以備圖像分析。應(yīng)用NIH ImageJ圖像分析軟件，調(diào)用“Neuron J”模塊，采用Sholl分析法(Sholl Analysis)，計量每個神經(jīng)元樹突分支節(jié)點(diǎn)總數(shù)。樹突棘密度用每10 μm長的二、三級樹突分支上樹突棘的個數(shù)表示。每只動物分析10個神經(jīng)元。

1.10 免疫熒光組織化學(xué)法檢測突觸素蛋白表達(dá)術(shù)后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛200 ml灌流固定，采集視交叉前后2 mm范圍的腦組織塊(含運(yùn)動皮質(zhì)區(qū))，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛4℃后固定過夜，轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的蔗糖溶液脫水至組織塊沉底，速凍后連續(xù)冠狀位切片，片厚30 μm。腦片收集于0.02 mol·L－1PBS緩沖液中，用含0.3%Triton X-100(體積比)的0.02 mol·L－1PBS漂洗3次后，正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;轉(zhuǎn)移腦片至小鼠抗p38單克隆抗體工作液中(稀釋比例為1∶200)，4℃過夜(14～16 h);0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片3次后，轉(zhuǎn)移至FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG工作液中(稀釋比例為1∶100);37℃避光孵育1 ～3 h;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片4次后，裱片，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。陰性對照用0.02 mol·L－1PBS代替小鼠抗p38單克隆抗體工作液，其余步驟相同。

1.11 Western blot檢測突觸素蛋白表達(dá) 術(shù)后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后經(jīng)心臟灌注生理鹽水100 ml，斷頭取腦;冰上分離缺血灶周圍殘存大腦皮質(zhì)，準(zhǔn)確稱量0.1 g，加入1 ml 4℃預(yù)冷的胞質(zhì)裂解液［成分為蔗糖 0.5 mol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1(pH 7.9)、MgCl21.5 mmol·L－1、KCl 10 mmol·L－1、EDTA 1 mmol·L－1、甘油 10%(V/V)、DTT 1 mmol·L－1、PMSF 1 mmol·L－1、Aprotinin 5 mg·L－1、Leupeptin 5 mg·L－1］，冰上勻漿，提取胞膜和胞質(zhì)蛋白。Bradford法測定抽提物中蛋白濃度。SDS-PAGE分離含40 μg蛋白的胞膜及胞質(zhì)抽提物;電泳結(jié)束，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜;TTBS洗膜后，用兔抗p38多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)和小鼠抗β-actin單克隆抗體(稀釋比例為1∶500)混合一抗工作液孵膜，4℃過夜(16～18 h);TTBS洗膜4次后，用AP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶15 000)和AP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶15 000)混合二抗工作液孵膜，37℃ 1 h;TTBS洗膜4次后，將膜片移入BCIP/NBT工作液中，避光顯色5～10 min;終止顯色反應(yīng)后，用自來水漂洗膜片，自然晾干后掃描并采集圖像。

1.12 半定量分析 免疫熒光組織化學(xué)染色切片置于熒光顯微鏡下觀察，每只大鼠觀察3張完整無損的腦片，200倍鏡下觀察和拍攝每張腦片PIC區(qū)陽性細(xì)胞分布密集的3個不同視野，圖像轉(zhuǎn)為灰度模式后，采用NIH ImageJ圖像分析軟件測定p38陽性著色區(qū)域積分光密度值(IOD)。取同一切片背景染色定標(biāo)，以減少非特異性染色和圖像采集過程中熒光參數(shù)變化影響熒光強(qiáng)度所造成的誤差。用各組3只大鼠共計9個視野的p38陽性著色區(qū)域平均IOD值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

Western blot膜片用ScanMaker E6系統(tǒng)掃描，并用Quantity one 4.5.1版圖像分析軟件(Bio-Rad公司產(chǎn)品)測定p38和內(nèi)參β-actin蛋白各顯色條帶的累積光密度值(IOD值)，計算p38與對應(yīng)的β-actin蛋白顯色條帶IOD值的比值，表示p38相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對大鼠感覺運(yùn)動功能恢復(fù)的影響 角落實驗顯示，pMCAO術(shù)前各實驗組大鼠左轉(zhuǎn)次數(shù)為4.8±0.3，右轉(zhuǎn)為5.2±0.3，軀體轉(zhuǎn)向偏好組間差異無顯著性(P＞0.05)。術(shù)后1 d(給藥前)和4 d，除假手術(shù)組外，各實驗組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失，右轉(zhuǎn)次數(shù)明顯增加，組間差異無顯著性(P＞0.05);術(shù)后7 d和15 d，梓醇各劑量組和胞磷膽堿組神經(jīng)缺失功能明顯恢復(fù)，較對應(yīng)時點(diǎn)模型組和生理鹽水組右轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少，組間差異具有顯著性(P ＜0.05)，見 Tab 1。

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model group and normal saline group，respectively

Group Days after pMCAO 1 d 4 d 7 d 15 d Sham operation 5.2 ±0.3 5.5 ±0.2 5.3 ±0.3 5.4 ±0.5 Model 9.6 ±0.6 9.5 ±0.5 9.2 ±0.8 9.0 ±0.7 Normal saline 9.7 ±0.5 9.5 ±0.6 9.4 ±0.5 8.8 ±0.4 Low dose of catalpol 9.7 ±0.3 9.6 ±0.7 8.6 ±0.4* 8.0 ±0.3*Middle dose of catalpol 9.8 ±0.6 9.4 ±0.5 8.4 ±0.7* 7.5 ±0.5*High dose of catalpol 9.8 ±0.7 9.2 ±0.8 8.0 ±0.4* 7.0 ±0.8*Citicoline 9.6 ±0.8 9.4 ±0.7 8.5 ±0.6* 7.8 ±0.4*

2.2 梓醇對大鼠腦梗死體積的影響 MRI顯示，假手術(shù)組未見腦梗死灶，pMCAO大鼠缺血病灶累及右側(cè)大腦半球前肢感覺運(yùn)動皮質(zhì)和紋狀體。術(shù)后1 d和15 d，各實驗組腦梗死體積差異無顯著性(P＞0.05)，見 Fig 1。

Fig 1 Lesion volume among groups(±s，n=6)

2.3 梓醇對PIC區(qū)神經(jīng)元樹突生長的影響 改良Golgi-Cox染色方法較穩(wěn)定可靠，各組大鼠大腦標(biāo)本均染色成功。鏡下見大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體、軸突、軸突分支、樹突、樹突分支和樹突棘著色均勻，形態(tài)清晰可辨。圖像分析結(jié)果顯示，各實驗組PIC區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，樹突分支和樹突棘密度較假手術(shù)組明顯減少(P＜0.05);梓醇組神經(jīng)元樹突分支較模型組和生理鹽水組均明顯增加(P＜0.05)，趨于假手術(shù)組水平(P＞0.05);胞磷膽堿組樹突分支數(shù)大于模型組，但差異無顯著性(P＞0.05)，且明顯少于梓醇組(P＜0.05)。各實驗組樹突棘密度變化趨勢與樹突分支的變化趨勢相似。提示腦缺血后PIC區(qū)神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度均明顯減少;梓醇可促進(jìn)神經(jīng)元樹突分叉，增加樹突棘密度，見Fig 2。

2.4 梓醇對PIC區(qū)突觸素(p38)蛋白表達(dá)的影響免疫熒光組織化學(xué)染色顯示，突觸素(p38)被FITC標(biāo)記，陽性著色部位呈大小較均勻的綠色小點(diǎn)或顆粒，主要分布在神經(jīng)氈內(nèi);部分陽性顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍，襯托出神經(jīng)元胞體的輪廓;部分神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見大量顆粒狀免疫反應(yīng)產(chǎn)物。圖像分析顯示，梓醇中、高劑量組p38陽性著色部位IOD值均明顯高于模型組和胞磷膽堿組(P＜0.05)，見Tab 2，F(xiàn)ig 3;Western blot檢測結(jié)果與此基本一致，見Fig 4。提示梓醇可上調(diào)腦缺血后PIC區(qū)p38蛋白表達(dá)。

Fig 2 Golgi-Cox staining shows the changes in dendritic branches and spine density of the survival pyramidal neurons in PIC among experimental groups

Fig 3 Protein expression of P38 in the PIC among groups(FITC labelling，200×)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

▲P＜0.05 vs sham operation;△P＜0.05 vs model;◆P＜0.05 vs normal saline;◇P＜0.05 vs Citicoline

Groups Value of IOD Sham operation 35611.51 ±2564.30 Model 32869.38 ±2769.17 Normal saline 34451.26 ±3392.86 Citicoline 38545.42 ±3592.01 Low dose of catalpol 39381.25 ±4656.33△Middle dose of catalpol 54826.05 ±1566.24▲△◆◇High dose of catalpol 63940.72 ±5127.41▲△◆◇

Fig 4 Western blot analysis of the protein expression of p38 in the PIC among groups(±s，n=3)

3 討論

缺血性腦卒中后，PIC區(qū)和對側(cè)大腦半球功能相似腦區(qū)神經(jīng)元軸突再生、樹突芽生和突觸重構(gòu)奠定了受損神經(jīng)環(huán)路修復(fù)重建的解剖學(xué)基礎(chǔ)［12］，直接關(guān)系到神經(jīng)功能恢復(fù)狀況。但目前還缺少有效的治療藥物促進(jìn)這些可塑性事件的發(fā)生。

本研究采用角落實驗觀察到，永久性腦缺血后24 h，延遲給予梓醇或胞磷膽堿干預(yù)均能促進(jìn)模型大鼠感覺運(yùn)動整合功能的恢復(fù)。已有研究證實［8］，角落實驗?zāi)芸陀^評估腦缺血模型動物慢性期的神經(jīng)缺失功能，腦缺血后90 d仍能檢出感覺運(yùn)動功能異常，檢驗效能和信度均高，優(yōu)于神經(jīng)功能評分和足失誤實驗。同時，頭顱MRI檢測證實，延遲給予梓醇干預(yù)并未有效縮小腦梗死體積，未顯示出缺血腦保護(hù)作用，提示梓醇很可能通過神經(jīng)保護(hù)以外的其他藥理作用機(jī)制(如促神經(jīng)修復(fù)等)發(fā)揮治療作用。

基于此，本研究采用Golgi-Cox染色發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后15 d，缺血灶周圍幸存錐體神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度均比假手術(shù)組明顯減少，證實腦缺血對神經(jīng)元樹突產(chǎn)生了明顯損害。梓醇組PIC區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支數(shù)目和樹突棘密度均比模型組明顯增加，提示梓醇可明顯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元樹突生長，增強(qiáng)樹突可塑性。樹突是神經(jīng)元接收、加工和整合輸入信息的基本部位。腦缺血后，神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度減少，阻礙了神經(jīng)元信息傳入，致使神經(jīng)元之間的信息傳輸和細(xì)胞水平的信號整合發(fā)生障礙，是腦缺血損傷后出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的重要原因［11，13］。樹突芽生和樹突棘密度增加可以提供更多表面進(jìn)行突觸發(fā)生，接受更多的軸突終末，有利于已有突觸連接的細(xì)胞間形成更多的突觸，或在以前沒有突觸連接的細(xì)胞之間建立新的突觸連接，有助于病灶周圍區(qū)神經(jīng)元突觸信號的傳入、處理以及受損神經(jīng)環(huán)路的修復(fù)和重建;并可有效阻止PIC區(qū)失去聯(lián)系的幸存神經(jīng)元因長期無法和其他細(xì)胞建立聯(lián)系而發(fā)生凋亡?？梢?，增強(qiáng)樹突可塑性可能是梓醇促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的重要神經(jīng)機(jī)制。

突觸是神經(jīng)細(xì)胞間相互聯(lián)系傳遞信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是神經(jīng)環(huán)路的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)與功能單位，也是腦缺血損傷的敏感部位。腦缺血后受累神經(jīng)元突觸數(shù)量減少，效能降低，神經(jīng)環(huán)路信息傳遞障礙是腦缺血后出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的另一重要因素［11］。突觸素p38是突觸囊泡的特異性糖蛋白，主要定位于突觸前終末內(nèi)，常作為突觸重構(gòu)的重要分子標(biāo)志之一。樹突是神經(jīng)元之間形成興奮性突觸的位置，樹突棘密度增加常常伴隨新的突觸形成和功能改善。梓醇促進(jìn)樹突生長，增加樹突棘密度的同時是否伴隨突觸重構(gòu)能力的增強(qiáng)非常值得探討。因此本研究采用免疫熒光組織化學(xué)染色和Western blot檢測了PIC區(qū)突觸素p38蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血后15 d，梓醇組PIC區(qū)突觸素p38表達(dá)明顯強(qiáng)于模型組，與課題組前期研究結(jié)果相符［5］，表明梓醇可增強(qiáng)PIC區(qū)幸存神經(jīng)元突觸重構(gòu)能力，有助于神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞、加工和儲存，這可能是梓醇促神經(jīng)修復(fù)的另一神經(jīng)機(jī)制。

此外，與既往相關(guān)報道一致［14－15］，本研究也證實胞磷膽堿可促進(jìn)缺血周圍區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹突芽生，上調(diào)突觸素表達(dá)，有助于腦卒中大鼠神經(jīng)缺失功能恢復(fù)，但作用不如梓醇明顯。

總之，本研究表明，梓醇可促進(jìn)腦缺血后病灶周圍皮質(zhì)神經(jīng)元樹突生長，增加樹突棘密度，增強(qiáng)突觸可塑性，為其促卒中后神經(jīng)修復(fù)提供了客觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)，并可能成為有效促進(jìn)卒中后神經(jīng)修復(fù)的候選藥物。

［1］ Hurtado O，Lizasoain I，Moro M A.Neuroprotection and recovery:recent data at the bench on citicoline［J］.Stroke，2011，42(1 Suppl):S33－5.

［2］ ?；埒P，萬 東，張 芬.地黃梓醇腦保護(hù)的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2009，34(23):2983－6.

［2］ Zhu H F，Wan D，Zhang F.Progress in studies of pharmacological action and mechanisms of catalpol on brain diease［J］.China J Chin Mat Med，2009，34(23):2983 －6.

［3］ 萬 東，?；埒P，羅 勇，等.梓醇促大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長的離體研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(17):1771－4.

［3］ Wan D，Zhu H F，Luo Y，et al.Study of catalpol promoting axonal growth for cultured cortical neurons from rats［J］.China J Chin Mater Med，2007，32(17):1771－4.

［4］ 祝慧鳳，萬 東，羅 勇，等.梓醇上調(diào)GAP-43表達(dá)伴隨局灶腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(9):1231－6.

［4］ Zhu H F，Wan D ，Luo Y，et al.Catalpol up-regulated GAP-43 protein expression and improved behavior outcome of focal cerebral ischemia rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(9):1231 － 6.

［5］ Wan D，Zhu H F，Luo Y，et al.Changes in synapse quantity and growth associated protein 43 expression in the motor cortex of focal cerebral ischemic rats following catalpol treatment［J］.Neural Regener Res，2011，6(18):1380 －5.

［6］ 萬 東，祝慧鳳，羅 勇，等.梓醇促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)修復(fù)的行為學(xué)觀察與評價［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28(9):1208－14.

［6］ Wan D，Zhu H F，Luo Y，et al.Obseversion and evaluation of a neurologic function recovery treatment with catalpol in rat after permanent middle cerebral artery occlusion［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(9):1208 －14.

［7］ Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472 － 6.

［8］ Zhang L，Schallert T，Zhang Z G，et al.A test for detecting longterm sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia［J］.J Neurosci Methods，2002，117(2):207 － 14.

［9］ 朱 繼，萬 東，唐文淵.改良線栓法制備大鼠局灶腦缺血模型［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(8):685 －7.

［9］ Zhu J，Wan D，Tang W Y.Application of modified suture in preparation of rat model of focal cerebral ischemia［J］.J Fourth Mil Med Univ，2008，29(8):685 －7.

［10］ Gibb R，Kolb B.A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain［J］.J Neurosci Methods，1998，79(1):1－4.

［11］ Papadopoulos C M，Tsai S Y，Cheatwood J L，et al.Dendritic plasticity in the adult rat following middle cerebral artery occlusion and Nogo-a neutralization［J］.Cereb Cortex，2006，16(4):529 －36.

［12］ Keyvani K，Schallert T.Plasticity-associated molecular and structural events in the injured brain［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2002，61(10):831 －40.

［13］程明高，廖維靖，楊萬同，等.豐富康復(fù)訓(xùn)練對大鼠腦缺血再灌注后功能恢復(fù)及神經(jīng)元樹突生長的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2006，12(3):203 －6.

［13］ Cheng M G，Liao W J，Yang W T，et al，Effects of enriched rehabilitative training on the functional recovery and neuronal dentritic growth following cerebral ischemia/reperfusion in rats［J］.Chin J Rehabil Theory Pract，2006，12(3):203 －6.

［14］ Hurtado O，Cardenas A，Pradillo J M，et al.A chronic treatment with CDP-choline improves functional recovery and increases neuronal plasticity after experimental stroke［J］.Neurobiol Dis，2007，26(1):105－11.

［15］ Gutierrez-Fernandez M，Rodriguez-Frutos B，F(xiàn)uentes B，et al.CDP-choline treatment induces brain plasticity markers expression in experimental animal stroke［J］.Neurochem Int，2012，60(3):310－7.