磷酸肌酸聯(lián)合缺血后適應(yīng)對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

張會珍，邢艷秋，肖 冬，章 萌，王 慧，寇學(xué)俊

(1.濟(jì)南醫(yī)院心內(nèi)科山東濟(jì)南 250013;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東濟(jì)南 250062;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東濟(jì)南 250012)

無論是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達(dá)國家，急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)仍然是威脅人類身體健康的一個全球問題。每年大約有數(shù)百萬世界人口的死亡都與 AMI有關(guān)，死亡率大約是10%，而且它也是慢性心力衰竭的主要病因［1］。早期開通罪犯血管，恢復(fù)缺血心肌的血流灌注仍然是最有效的治療措施。然而再灌注損傷不可避免。缺血后適應(yīng)作為一種新的治療策略能夠有效的減輕心肌再灌注損傷，但它的不足之處是由于再灌注過程中反復(fù)的缺血損害了細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生［2］。磷酸肌酸(phosphocreatine PCr)是一種高能磷酸化合物，在心肌急性缺血時應(yīng)用外源性磷酸肌酸可以減少心肌酶的釋放，縮小心肌梗死面積，但其對缺血心肌的保護(hù)機制目前還不是完全清楚。本研究旨在探討外源性磷酸肌酸聯(lián)合缺血后適應(yīng)對再灌注損傷心肌的保護(hù)作用，并從促炎細(xì)胞因子水平和細(xì)胞凋亡通路方面研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康、♂、SPF級Wistar大鼠40只，體質(zhì)量260～290 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK魯20090001。動物分籠飼養(yǎng)，室溫控制在(20～24)℃，濕度為(50～60)%，飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料均經(jīng)滅菌后動物自由食用。

1.2 藥品與試劑 磷酸肌酸(商品名:里爾統(tǒng))，1 g/支，批號:6252，意大利阿爾法韋士曼制藥公司生產(chǎn)。肌酸激酶(CK)試劑盒，批號:20111219，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，批號:20111216，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒，批號:20110730，南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)。TNF-α ELISA試劑盒由武漢伊艾博科技有限公司生產(chǎn)。兔抗大鼠磷酸化Akt(Ser473)抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體由美國Cell Signaling公司生產(chǎn)。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG由北京中杉金橋生物技術(shù)公司生產(chǎn)。伊文思藍(lán)(Evans blue)，美國Sigma公司生產(chǎn)。氯化三苯基四氮唑(TTC)，美國Amresco公司生產(chǎn)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

1.3 實驗儀器 小動物呼吸機(江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司)、離心機(Bechman公司)、酶標(biāo)儀(Thermo公司)、電子天平(上海精科公司)、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽(美國BIO-RAD公司)等均由山東大學(xué)教育部、衛(wèi)生部心血管重構(gòu)與功能研究重點實驗室提供。

1.4 模型制備及分組 大鼠心肌缺血/再灌注模型的建立:40只大鼠采用30 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔麻醉，氣管切開后連接小動物呼吸機進(jìn)行機械通氣(呼吸比1∶1.5，呼吸頻率60次/分)，分離肌層，沿胸骨左緣切開第3、4肋間，剪開心包，暴露心臟，在左心耳下方2 mm，肺動脈圓錐左緣之間穿線進(jìn)針，以冠狀靜脈為標(biāo)志穿入7-0絲線用于結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，同時將一內(nèi)徑1.5 mm的乳膠管至于結(jié)扎線和LAD之間，拉緊結(jié)扎線使乳膠管壓迫LAD，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，拔出乳膠管，冠狀動脈再通，形成再灌注。實驗中以左室前壁出現(xiàn)紫紺及心電圖標(biāo)II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高為心肌缺血成功標(biāo)志。冠狀動脈阻塞之前經(jīng)尾靜脈推注肝素鈉(300 U·kg-1)抗凝。Wistar大鼠編號按抽簽法隨機分為4組(n=10)，均予心肌缺血30 min，再灌注120 min處理:(1)I/R組，缺血30 min后直接再灌注;(2)IPost組，再灌注前給予3次再灌注10 s/缺血10 s處理;(3)PCr組，再灌注前5min經(jīng)股靜脈緩慢推注PCr 200 mg·kg-1;(4)PCr+IPost組，再灌注前5 min給予PCr 200 mg·kg-1，同時再灌注前予3次再灌注10 s/缺血10 s處理。I/R組、IPost組分別給予等量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與處理 (1)于再灌注2 h末，經(jīng)股靜脈取血 2 ml，3 000 r·min-1離心 15 min，取上清于-80℃冰箱保存待測。于再灌注2 h末每組隨機抽取3只大鼠，取左室前壁缺血區(qū)心肌組織作Western blot檢測，每組剩余7只大鼠用于心肌梗死面積測定。(2)血清CK、LDH、MPO活性測定:采用比色法測定CK、LDH、MPO各指標(biāo)的酶活力，具體操作參照試劑盒說明書。(3)血清 TNF-α檢測:采用ELISA方法進(jìn)行TNF-α檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本測得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定TNF-α蛋白的含量。(4)Western blot檢測心肌組織磷酸化Akt蛋白(P-Akt)和Bcl-2蛋白表達(dá):取待測心肌約60 mg提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗滌后將硝酸纖維膜置于一抗中孵育，P-Akt、Bcl-2、β-actin的稀釋比例分別為1 ∶300、1 ∶500、1 ∶1 000，4℃反應(yīng)過夜，TBS-T漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗，稀釋比例分別為1 ∶5 000、1 ∶10 000、1 ∶20 000，化學(xué)發(fā)光顯影。以 P-Akt/β-actin及 Bcl-2/β-actin灰度比值表示蛋白表達(dá)的半定量水平。(5)心梗面積測定:實驗結(jié)束后，原位結(jié)扎冠狀動脈，經(jīng)頸靜脈注入1%的Evans藍(lán)2～3 ml，將非缺血心肌染成藍(lán)色，從而顯示出缺血危險區(qū)(AAR)心肌。10%氯化鉀處死動物，立即摘取心臟，去除大血管、心房及右心室，-20℃冷凍10 min，沿左心室(LV)長軸橫切為4～5片厚約1～2 mm的心肌片，將之置于1%氯化三苯基四氮(TTC)中，于37℃孵育20 min，此時壞死區(qū)(AN)呈灰白色，非壞死心肌呈磚紅色，非缺血區(qū)心肌呈藍(lán)紫色。最后將切片置于10%甲醛中固定30 min，光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)將AN心肌及非梗死的AAR心肌分開。將分離好的心肌組織分別稱重，心肌缺血面積以缺血區(qū)心肌重量/左室重量(AAR/LV)來表示，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量(AN/AAR)來表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。多組均數(shù)及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD法)，兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組血清 CK、LDH、MPO活性及 TNF-α變化IPost組、PCr組、PCr+IPost組較 I/R 組 CK、LDH、MPO活性及TNF-α明顯降低(P＜0.05);PCr+IPost組與 IPost組、PCr組相比，CK、LDH、MPO 活性和TNF-α進(jìn)一步降低(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of serum CK，LDH，MPO and TNF-α in each experimental group(±s，n=10)

Tab 1 Comparison of serum CK，LDH，MPO and TNF-α in each experimental group(±s，n=10)

☆P＜0.05 vs I/R group;△P＜0.05 vs IPost group and PCr group

Group CK/U·L-1 LDH/×103U·L-1 MPO/U·L-1 TNF-α/ng·L -1 I/R 16.42±2.74 5.21±0.34 73.16±8.41 34.95±5.12 IPost 8.74±1.19☆ 2.90±0.14☆ 37.48±6.36☆ 17.46±1.97☆PCr 9.04±1.42☆ 2.80±0.12☆ 36.65±3.71☆ 16.81±2.17☆PCr+IPost5.79±1.34☆△ 1.85±0.15☆△ 19.92±4.16☆△ 10.83±1.63☆△

2.2 心肌缺血及梗死面積比較結(jié)果 各組大鼠間體重、左心室重量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PCr+IPost組缺血危險區(qū)面積(AAR/LV)小于IPost組、PCr組和I/R組(P＜0.05)，其余3組間AAR/LV差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IPost組、PCr組和PCr+IPost組心肌梗死面積小于I/R組(P＜0.05)，PCr+IPost組小于IPost組、PCr組(P ＜0.05)，見 Tab 2。

Tab 2 Percentages of risk area and infarct size(±s，n=7)

Tab 2 Percentages of risk area and infarct size(±s，n=7)

☆P＜0.05 vs I/R group;#P＜0.05 vs IPost group and PCr group

Group BW/g LV/g AAR/LV/% AN/AAR/%I/R 278.24±3.34 0.79±0.02 36.74±5.13 51.04±3.88 IPost 280.83±11.12 0.80±0.05 35.62±3.22 38.27±2.67☆PCr 279.48±6.79 0.79±0.06 35.40±4.18 35.78±3.57☆PCr+IPost 275.20±8.56 0.78±0.03 24.85±3.10☆# 18.52±1.33☆#

2.3 心肌組織P-Akt及Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果IPost組、PCr組、PCr+IPost組 P-Akt蛋白表達(dá)均明顯高于 I/R組(0.228±0.012、0.214±0.011、0.418±0.012比0.094±0.009，P 均 ＜0.05)。IPost組、PCr組、PCr+IPost組Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯高于I/R 組(0.234±0.012、0.475±0.013、0.749±0.016比0.139±0.011，P 均 ＜0.05)。PCr+IPost組 PAkt及Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于IPost組、PCr組(P＜0.05)，見 Fig 1。

Fig 1 Results of Western blot detection of left ventricular anterior ischemic myocardium P-Akt and Bcl-2 protein expression

3 討論

盡管近年來心血管疾病研究飛速發(fā)展，但缺血性心臟病仍然是世界主要的死因［3］。目前，已經(jīng)開展的及時開通罪犯血管的治療手段不可避免的帶來了心肌缺血/再灌注損傷。缺血后適應(yīng)能有效減輕再灌注損傷。L?nborg等［4-5］研究顯示，介入時配合缺血后適應(yīng)操作可以明顯減少心肌酶的釋放、改善左室功能。PCr是一個非常重要的能量底物，且它與心肌組織有特別高的親和性，很容易被心臟吸收，故磷酸肌酸可能成為減輕再灌注損傷的理想藥物。因藥物后適應(yīng)與缺血后適應(yīng)一樣有更好的臨床應(yīng)用前景，故我們首次建立了PCr后適應(yīng)動物模型。我們研究發(fā)現(xiàn)，PCr及IPost均能明顯降低血清 CK、LDH的釋放和心肌梗死面積，對缺血/再灌注心肌起到了很好的保護(hù)作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用心肌梗死面積進(jìn)一步減少，對缺血/再灌注心肌起到了更好的保護(hù)作用。

在心肌缺血/再灌注損傷中，細(xì)胞凋亡占有重要地位［6］。PI-3K(phosphatidyl-inositol-3 kinase，磷酯酰肌醇-3激酶)/Akt/Bcl-2途徑是主要的抗細(xì)胞凋亡的通路之一［7］。Shroff等［8］研究顯示 PI-3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng);Yu等［9］研究顯示應(yīng)用PI-3K抑制劑wortmannin可以明顯下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。PCr作為一種心肌保護(hù)劑，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，但是其通過何種上游途徑發(fā)揮抑制凋亡作用，目前尚無相關(guān)報道。我們首次研究發(fā)現(xiàn)PCr后適應(yīng)可以明顯上調(diào)心肌組織中P-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)，心肌梗死面積及心肌酶明顯降低，由此提示磷酸肌酸抑制細(xì)胞凋亡的上游機制可能是通過激活P-Akt/Bcl-2信號通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。而且我們也研究發(fā)現(xiàn)PCr+IPost，心肌組織P-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，心梗面積進(jìn)一步減少，兩者聯(lián)合應(yīng)用對缺血/再灌注心肌起到了更好的保護(hù)作用。關(guān)于PCr+IPost是通過何種途徑促進(jìn)PI-3K活化、上調(diào)P-Akt蛋白，我們推測可能與共同激活細(xì)胞表面的腺苷受體有關(guān)，進(jìn)一步可以通過應(yīng)用腺苷受體阻斷劑來證實。

目前，關(guān)于炎癥因子和I/R損傷的關(guān)系也逐漸成為一種共識。TNF-α是一個有力的促炎細(xì)胞因子，它可激活并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在組織中黏附、聚集，而中性細(xì)胞的激活又可以增加許多促炎細(xì)胞因子如TNF-α的產(chǎn)生，從而起到信號級聯(lián)放大效應(yīng)，加重了心肌炎癥反應(yīng)，造成明顯的再灌注損傷［10-11］。MPO作為一種主要由中性粒細(xì)胞釋放的酶，因此MPO活性測定成為反映中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥反應(yīng)程度廣泛使用的生物標(biāo)志物［11］。我們對TNF-α和MPO進(jìn)行Spearman相關(guān)分析顯示兩者呈明顯的正相關(guān)(rs=0.736，P＜0.01)，由此也進(jìn)一步說明TNF-α與組織的炎性浸潤程度之間存在著密切關(guān)系。我們研究發(fā)現(xiàn)，IPost及PCr后適應(yīng)均可以明顯抑制TNF-α和MPO活性，兩者聯(lián)合應(yīng)用血清TNF-α和MPO水平進(jìn)一步減低，由此可見，兩者發(fā)揮心臟保護(hù)作用機制可能與抑制組織的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，磷酸肌酸后適應(yīng)聯(lián)合缺血后適應(yīng)可以明顯減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，其保護(hù)機制可能與共同激活PI-3K/Akt/Bcl-2信號通路和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。因兩者聯(lián)合應(yīng)用可以明顯保護(hù)大鼠缺/血再灌注心肌，因此它們可能為臨床再灌注損傷的預(yù)防開辟了一條新的治療方法和思路。

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