乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫組化對照芯片制作及其應(yīng)用

朱憶凌，周新木，龔偉，黎慶榮，黃淵

（麗水市中心醫(yī)院暨溫州醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 病理科，浙江 麗水 323000）

免疫組化技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于病理診斷工作中，在病理診斷、術(shù)后治療和預(yù)后評估等方面發(fā)揮了重要作用。乳腺癌術(shù)后雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR），以及原癌基因CerbB-2的測定，已廣泛應(yīng)用于臨床。ER、PR陽性表達為術(shù)后內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)；CerbB-2是乳腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一，其過度表達提示腫瘤細胞復(fù)發(fā)率高，對化療和內(nèi)分泌治療不敏感[1]。目前，大多數(shù)醫(yī)院采用國內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn)來判定CerbB-2染色結(jié)果的陽性強度，但是在判讀中存在主觀上的不穩(wěn)定性，尤其是CerbB-2++的判讀可重復(fù)性不高[2]。ER、PR免疫組化染色結(jié)果目前尚無統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)。另外，免疫組化技術(shù)本身影響質(zhì)量的因素較多，設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ赵谌橄侔┟庖呓M化實驗中是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。組織芯片具有體積小、信息含量高、快速、低消耗和可比性強等特點[3]，我們利用組織芯片制作的原理，改進芯片制作技術(shù)，在同一張切片上設(shè)立等級表達陽性對照和陰性對照，使得染色結(jié)果判讀更為可靠，觀察更加客觀和方便，且方法簡便可行，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料 從我院病理科檔案免疫組化染色切片中篩選出乳腺癌ER、PR和CerbB-2具有清晰染色結(jié)果的病例，獲得表達水平依次為-、+、++和+++的乳腺癌組織。自制采樣器（內(nèi)徑1.8 mm的平頭穿刺套管一套），APES涂膠片，免疫組化試劑一抗ER、PR和CerbB-2及EnVision TM Plus檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 染色結(jié)果的判斷 CerbB-2免疫組化染色結(jié)果采用國內(nèi)通用標(biāo)準(zhǔn)，陽性表達位于腫瘤細胞的胞膜，根據(jù)陽性細胞所占的百分數(shù)進行分組。評分標(biāo)準(zhǔn)：未見著色或<10%的腫瘤細胞膜著色，或僅有胞質(zhì)非特異著色為-；>10%的腫瘤細胞陽性表達，顯色弱且不連續(xù)為+；>10%的腫瘤細胞膜陽性表達，連續(xù)胞膜顯色，強度中等為++；>10%的腫瘤細胞膜呈連續(xù)的強陽性表達為+++[1]。ER、PR以細胞核內(nèi)有棕色顆粒為陽性，采用陽性百分比計數(shù)法：陽性表達<10%為-；陽性表達10%～30%為+；陽性表達30%～50%為++；陽性表達>50%為+++[4]。

1.3 組織芯片對照片的構(gòu)建 復(fù)查HE及免疫組化染色切片，選擇最具代表性的區(qū)域，畫圈標(biāo)記，再在組織蠟塊上相應(yīng)的區(qū)域進行標(biāo)記。用自制采樣器，從供體蠟塊中采集組織芯，并按-、+、++和+++的次序依次放好。取出1 cm×1 cm包埋模具，先在模具底部滴入少許蠟液，放置加熱臺使其熔化，依次放入所取組織芯，緊密排成一行，然后將模具移置冷卻臺稍冷卻，使組織芯位置稍固定后如同常規(guī)一般完成包埋。包埋盒書寫號碼側(cè)與陰性對照一側(cè)一致。將組織芯片蠟塊進行連續(xù)切片，厚度4μm，裱貼APES涂膠載玻片的一端。60 ℃烤箱內(nèi)烤片一夜后取出，儲藏于干燥的切片盒內(nèi)備用。

1.4 免疫組化染色 當(dāng)常規(guī)病例需要做免疫組化染色時，從備用盒中取出1張對照芯片，將常規(guī)測試病例組織切片后，裱在對照芯片旁邊，然后同時進行烤片、脫蠟、高壓抗原熱修復(fù)以及免疫組化EnVision染色，DAB顯色，蘇木精襯染，脫水、透明封固（見圖1）。

圖1 采樣器、制成的蠟塊與對照芯片

2 結(jié)果

手工制作對照芯片耗時短，方法簡便，組織蠟芯排列整齊有序，無移位。在免疫組化染色時對對照芯片進行了測試，對照芯片無皺褶，抗原修復(fù)時無掉片。對照芯片與被測組織相鄰，界限清楚，易于閱片，并且不影響被測組織的染色。對照芯片中乳腺癌組織ER、PR及CerbB-2-、+、++和+++免疫組化染色陽性信號清楚，強弱有差異，反映出乳腺癌組織中各抗原含量不同。顯微鏡下觀察，對照芯片排列整齊，閱片者很容易相互參照查對陽性點位的染色狀況（見圖2-3），可以根據(jù)對照片內(nèi)的組織染色狀況判定受測組織是否進行了正確的染色過程，并且可以參照已知的陽性對照片染色給予受測組織較客觀的判讀。

3 討論

乳腺癌為女性高發(fā)腫瘤，近幾年發(fā)病率逐年上升，而病死率卻逐年下降。這在很大程度上得益于對患者病情的準(zhǔn)確判斷及有針對性的治療。檢測乳腺癌ER、PR及CerbB-2表達情況，可指導(dǎo)內(nèi)分泌治療和靶向治療，因此乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化檢測的質(zhì)量控制顯得十分重要[5]。

圖2 CerbB-2免疫組化結(jié)果模式圖

圖3 PR免疫組化結(jié)果模式圖

在進行乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色時，為了確保染色片的質(zhì)量和判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性，必須設(shè)立合理的對照，避免假陽性、假陰性結(jié)果以及主觀判讀的不穩(wěn)定性。而通常的免疫組化對照法常采用外對照實驗，抗體種類越多，準(zhǔn)備的外對照切片種類就越多，因此組織耗費多且費時、費力；同時由于陽性對照組織與待測組織不在同一張載玻片上，實驗條件無法達到完全一致[6]，如各步驟的時間、試劑的用量、抗原修復(fù)狀況或其他人為因素等存在差異，均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，使得免疫組化結(jié)果的判讀缺乏可靠性。并且僅做強陽性對照片對照評估乳腺癌ER、PR和CerbB-2免疫組化染色結(jié)果是不準(zhǔn)確的，對于強陽性病例，即使染色敏感性降低，仍可能呈陽性表達，因此乳腺癌免疫組化實驗中制作單一抗體的不同陽性程度的對照片十分必要[7]。

我們運用組織芯片技術(shù)在乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色中設(shè)立等級對照具備以下優(yōu)點：①組織芯片可根據(jù)不同需要進行組合和靈活設(shè)計，鑒于乳腺癌免疫組化染色結(jié)果判讀的要求，我們選取以往ER、PR、CerbB-2免疫組化染色信號為-、+、++和+++表達清楚的乳腺癌組織為對照，制成對照芯片。陰性和不同等級的陽性組織均包含在內(nèi)，比傳統(tǒng)的單一陽性對照更可靠，更有效。②檢測組織和對照芯片在同一張載玻片上，在相同條件下進行免疫組化染色，保證了實驗條件的一致性，使結(jié)果更具可比性。③組織芯片對照片排列規(guī)整，與被測組織相鄰，界線清楚，非常方便診斷醫(yī)師閱片和查對。④組織芯面積很小，供體蠟塊被破壞程度小，取出組織芯后，供體蠟塊仍可存檔保留。同時免疫組化染色切片歸檔保存時不需要另外單獨保存陽性對照切片，更有利于檔案管理。⑤組織芯蠟塊制備后，可以一次性連續(xù)切取對照組織芯片數(shù)張，烤片后備用。為保證對照芯片的有效性，我們對不同保存時間的芯片進行免疫組化染色，結(jié)果證明對照芯片在室溫條件下保存6個月內(nèi)，其抗原性保存較好，不會出現(xiàn)抗原丟失，避免了重復(fù)切片造成的修片損失，且省時省力。⑥應(yīng)用組織芯片技術(shù)制作使用的陽性對照組織比較小，節(jié)約了試劑的使用，降低了成本。⑦經(jīng)過對組織芯片制作過程的改良，用自制采樣器手工組織芯片制作過程十分簡單，花費時間少。取樣后，將組織芯按次序放入模具內(nèi)按常規(guī)方法包埋，避免了用空白蠟塊打孔后將組織芯埋入時出現(xiàn)的融合不夠?qū)е虑衅щy、組織缺失、飄散的現(xiàn)象。

總之，乳腺癌ER、PR、CerbB-2免疫組化染色設(shè)立等級對照十分必要，手工自制對照芯片方法簡單，花費成本低，實用性強，值得臨床推廣應(yīng)用。

[1] 董春鴿,章杰,吳亮,等. 乳腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化與預(yù)后因素的相關(guān)性[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,41(2):132-135.

[2] 王翠芝,周小鴿,黃受方,等.陽性對照組織芯片在乳腺癌CerbB-2免疫組化染色中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志,2006,13(4):316-317.

[3] 祁旦已,王繁,周伶俐,等.組織芯片技術(shù)檢測Galectin-3和CD44v6在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,39(1):43-46.

[4] 郭歡續(xù),白歐.乳腺癌ER、PR、Her-2表達與臨床病理特征[J].中國實驗診斷學(xué)雜志,2008,12(11):1390-1393.

[5] 吳秉銓,李玲.HER-2/neu基因和乳腺癌研究進展的啟迪[J].中華病理學(xué)雜志,2002,31(3):197-198．

[6] 王翠芝,周小鴿,黃受方,等. 組織芯片在免疫組化染色陽性對照中的應(yīng)用[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2006,22(4):481-484.

[7] 郎志強,魏兵,唐源,等.免疫組化對照芯片的設(shè)計和應(yīng)用[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2005,21(2):235-236.