HPLC法測定蟾酥中4種蟾毒內(nèi)酯

徐玲玲， 蔡國琴， 敬應(yīng)春， 張 聰*

(1.上海市中醫(yī)藥大學，上海201203;2.上海市中藥研究所，上海201400)

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufobufogargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物，經(jīng)加工干燥制成［1］。其功效有解毒、鎮(zhèn)痛、強心、抗腫瘤、開竅醒神等作用［2-6］。蟾酥作用廣泛，藥理活性較強，其有效成分為一些骨架相同的甾體化合物，總稱蟾毒內(nèi)酯［7］。

《中國藥典》2010年版一部規(guī)定了用高效液相色譜法測定蟾酥中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的標準，規(guī)定其總量不得少于6.0%?？疾煜嚓P(guān)文獻，多是對蟾酥中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基2個指標的測定［8-11］，而國內(nèi)外同時對4種蟾毒內(nèi)酯測定的報道則較少［12-13］。本實驗采用超聲提取，提取方式簡便快捷，HPLC法同時對蟾酥中蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基4個指標成分進行了測定，并對不同來源蟾酥藥材中的這4個指標成分進行檢測。這4種蟾毒內(nèi)酯既是有毒成分又是活性成分，對其合理精確監(jiān)控有其實際意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀 (VMD檢測器);Agilent1100高效液相色譜儀 (DAD檢測器);島津LC—10ATVP高效液相色譜儀 (SPD檢測器);CQ—250型超聲波清洗器 ［(33±3)kHz，250 W，上海新超超聲波儀器有限公司］;TGL—16C臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠);BS224S電子天平 (Sartorius);Milli—Q超純水機 (Milli—Pore)。

1.2 材料 蟾毒靈 (bufalin，批號:1044-100412，江西本草天工科技有限公司，純度≥98%);蟾蜍他靈 (bufotalin，批號:E-0532，天津藥物研究院，純度≥98%);華蟾酥毒基(cinobufagin，批號:110803-200605，中國藥品生物制品檢定所);脂蟾毒配基 (resibufogenin，批號:110718-200507，中國藥品生物制品檢定所)。

蟾酥藥材，共10批，均從上海華宇藥業(yè)有限公司購進。

試劑:乙腈 (HPLC級，Merck);CF3COOH(CP，純度≥99%，國藥化學試劑有限公司);甲醇 (AR，國藥化學試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相A為乙睛，B為0.04%三氟乙酸溶液，0～5 min，B相從90%線性改變至85%，5～15 min，B相從85%線性改變至70%，15～30 min，B相從70%線性改變至60%，30～40 min，B相從60%線性改變至32%，40～45min，B相從32%線性改變至20%，45～50 min，B相保持20%;體積流量1.0 mL/min;柱溫35℃;檢測波長296 nm;進樣量20 μL。

2.2 對照品、供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品置五氧化二磷干燥器中真空干燥24 h;分別取各對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量溶解，定容，制成各對照品貯備液。

分別精密量取蟾蜍他靈貯備液5 mL、蟾毒靈貯備液7 mL、華蟾酥毒基貯備液15 mL、脂蟾毒配基貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，混勻，用甲醇定容至刻度，作為混合對照品貯備液 (含蟾蜍他靈40.29 μg/mL、蟾毒靈 58.00 μg/mL、華蟾酥毒基 126.48 μg/mL、脂蟾毒配基 43.68 μg/mL)。

精密量取5 mL混合對照品貯備液，置10 mL量瓶中，加水至近刻度，冷至室溫，定容，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蟾酥藥材細粉25 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，超聲提取30 min，冷至室溫，再次定容，搖勻，離心 (12000 r/min，10 min)，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性和系統(tǒng)適用性實驗 取混合對照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進樣檢測，采集DAD三維圖譜，結(jié)果表明，各指標成分色譜峰理論塔板數(shù)均大于20000、分離度均大于2.0、峰純度均大于995。相關(guān)圖譜見圖1。

圖1 對照品溶液 (A)和供試品溶液 (B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of referance substances(A)and sample solution(B)

2.4 線性關(guān)系實驗 精密吸取混合對照品溶液(含蟾蜍他靈 26.075 μg/mL、蟾 毒靈 49.635 μg/mL、華蟾酥毒基 50.25 μg/mL、脂蟾毒配基51.8 μg/mL)2、10、20、40、100 μL 注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，以各指標成分進樣量 (μg)為橫坐標，峰面積 (mAU*S)為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。

蟾蜍他靈回歸方程為:y=674.85x +0.4231，R2=1，在0.05 μg ～2.61 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。蟾毒靈回歸方程為:y=732.02x+0.8528，R2=1，在 0.10 μg ～ 4.96 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。華蟾酥毒基回歸方程為:y=779.63x+2.44，R2=1，在0.10 μg ～5.03 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。脂蟾毒配基回歸方程為:y=655.34x+0.6777，R2=1，在0.10 ～5.18 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 儀器精密度實驗 取混合對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進樣6次，以各指標成分色譜峰的峰面積計算蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD值分別為0.06%、0.04%、0.11%、0.04%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 中間精密度實驗 取同一批蟾酥藥材粉末(批號:H2010070606)，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，考察不同人員、不同時間、不同儀器測定結(jié)果的精密度。結(jié)果表明，不同時間、不同人員、不同儀器蟾蜍他靈測定結(jié)果的RSD分別為1.48%、0.82%、0.60%，蟾毒靈測定結(jié)果分別為0.31%、0.77%、1.12%，華蟾酥毒基測定結(jié)果分別為0.49%、0.74%、1.62%，脂蟾毒配基測定結(jié)果分別為0.54%、0.85%、1.16%，4種指標成分的RSD值均小于2.0%，該方法的中間精密度符合規(guī)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一批蟾酥藥材粉末，按上述方法制備供試品溶液，平行制備6份，在上述色譜條件下進行測定，結(jié)果顯示蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD值分別為0.33%、0.46%、0.47%、0.51%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一份蟾酥供試品溶液，按上述色譜條件，分別在制備后0、4、8、12、24、48、72 h測定，以各指標成分色譜峰的峰面積計算，蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的 RSD值分別為 0.40%、0.39%、0.21%、0.29%，結(jié)果表明樣品在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率實驗 取蟾酥藥材 (批號:H2010070606)粉末5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密加入混合對照品貯備液2.0 mL(含蟾蜍他靈40.29 μg/mL、蟾毒靈 58.00 μg/mL、華蟾酥 毒 基 126.48 μg/mL、脂 蟾 毒 配 基 43.68 μg/mL)，補水2.0 mL，搖勻，冷至室溫，用50%甲醇定容至刻度;超聲提取30 min，冷至室溫，再次定容，搖勻，離心 (12000 r/min，10 min)，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測定，蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均加樣回收率分別為97.62%、97.34%、97.23%、97.34%，RSD 值 分 別 為1.43%、1.59%、1.74%、1.55%。相關(guān)數(shù)據(jù)見表1～表4。

表1 蟾蜍他靈回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests of bufotalin

表2 蟾毒靈回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of bufalin

表4 脂蟾毒配基回收率實驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests of resibufogenin

2.10 樣品測定 取10批蟾酥藥材，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，并按外標一點法計算藥材中各指標成分含有量。測定結(jié)果見表5。

表5 不同來源10批蟾酥藥材測定結(jié)果Tab.5 Results of content determination of Bufonis Venom from different sources

10批藥材測定結(jié)果顯示，藥材中蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基含有量相對穩(wěn)定，脂蟾毒配基含有量則波動較大，批號為H2010020107的蟾酥藥材中脂蟾毒配基含有量小于1%，含有量明顯偏低，批號為 H2007092002、H2010062301、H2006080102的蟾酥藥材中脂蟾毒配基含有量都高達5%以上，對比之下，不同來源的蟾酥藥材中脂蟾毒配基的含有量不穩(wěn)定，差異較大。

根據(jù)目前的結(jié)果可暫定各指標成分含有量限度為:按干燥品計蟾蜍他靈應(yīng)不小于1.0%、蟾毒靈應(yīng)不小于2.0%、華蟾酥毒基應(yīng)不小于4.0%、脂蟾毒配基應(yīng)不小于0.9%。

3 討論

3.1 提取條件的選擇 比較回流與超聲2種提取方式的提取效果，從實驗結(jié)果得知回流提取和超聲提取效果沒有明顯差別，考慮到實驗操作的簡便快捷，故選擇超聲提取作為提取方法，超聲時間為30 min?？疾觳捎贸曁崛〉奶崛》绞胶?，比較不同比例甲醇 (甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇)、不同比例乙醇 (乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇)以及水為溶劑的提取效果，從數(shù)據(jù)對比結(jié)果來看，甲醇提取效率整體優(yōu)于乙醇，綜合考慮峰數(shù)目和主峰面積大小，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的選擇 比較 TC-C18、SB-C18、XDB-C18、Kromasil C18以及 Extend-C18等5款色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱最為適合該檢測方法，故用此色譜柱作為測定用分析柱。比較乙腈-1.0%甲酸溶液、乙腈－5.0%乙酸溶液、乙腈-0.04%三氟乙酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、以及乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液 (pH=3.2)、乙腈-10 mmol/L醋酸鈉溶液 (pH=3.21)為流動相體系時的分離效果，結(jié)果表明，乙腈-0.04%三氟乙酸溶液的分離效果最好，故選用此體系作為流動相。比較25℃、30℃、35℃、40℃等四種不同色譜柱溫度下的分離效果，結(jié)果表明，35℃時分離效果最佳，因此確定柱溫為35℃。

3.3 測定波長的選擇 根據(jù)蟾蜍他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的紫外光譜的吸收特征，從DAD三維圖譜中提取蟾酥對照品的UV光譜，最大吸收波長主要集中在290到310 nm之間，在《中國藥典》2010年版一部蟾酥項下含量測定采用的檢測波長296 nm處，能兼顧各成分的檢測靈敏度，因此確定測定波長為296 nm。

3.4 方法評價 本實驗采用超聲提取的方式，實驗方法簡便快捷，結(jié)果穩(wěn)定可靠，通過對不同來源蟾酥藥材中的4種指標成分的含有量測定，對蟾酥的質(zhì)量標準以及合理使用中藥蟾酥提供了依據(jù)，對含有蟾酥成分的六神丸、麝香保心丸等的合理應(yīng)用提供了參考［14］。

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