產(chǎn)益康栓對(duì)產(chǎn)后大鼠陰道組織MMP-1、TIMP-2表達(dá)的影響及其與盆底功能障礙的關(guān)系

瞿東暉，楊雪萍，董 敏

(1.甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000)

盆底功能障礙(pelvic floor dysfunction，PFD)又稱盆底缺陷或盆底支持組織松弛，主要包括子宮脫垂等盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)、大便失禁、壓力性尿失禁(stress urinary incontience，SUI)和女性性功能障礙等。PFD可發(fā)生在任何年齡，15～64歲女性人群中占10% ～55%，患病率占女性人口的40%～60%以上，嚴(yán)重影響著女性的健康和生活質(zhì)量，有預(yù)測(cè)30年后PFD的發(fā)病率將增加1倍［1］。近年來引起婦產(chǎn)科學(xué)界廣泛的關(guān)注，預(yù)防其發(fā)病迫在眉睫。產(chǎn)后是PFD的高發(fā)期，正常分娩后，陰道腔擴(kuò)大，陰道壁松弛及肌張力低，會(huì)陰部撕裂或切口縫合后硬結(jié)、水腫，盆底肌及筋膜因分娩過度擴(kuò)張彈性減弱，且伴有肌纖維部分?jǐn)嗔训?。盆底支持組織中的膠原蛋白以I型和Ⅲ型為主，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原酶［2］，組織金屬蛋白酶抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)是其抑制劑。因此本實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)益康對(duì)產(chǎn)后大鼠MMP-1、TIMP-2表達(dá)的影響，探討其預(yù)防及治療PFD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 已孕SPF級(jí)SD大鼠40只，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(甘)2011-0001。所有妊娠大鼠均在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，直至自然分娩。

1.1.2 藥品與試劑 產(chǎn)益康栓由甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院中藥房制劑室制備成栓劑;生理鹽水，批號(hào):2011030801;碘伏，批號(hào):2011062301;MMP-1兔抗鼠多克隆抗體，批號(hào):BA1270，兔抗鼠TIMP-2多克隆抗體，批號(hào):BA0576，即用型 SABC(SA1022-兔 IgG)試劑盒，DAB顯色試劑盒(AR1022)均購自武漢博士德公司。

1.1.3 儀器 成都泰盟BI-2000圖像分析系統(tǒng)(免疫組化分析軟件)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 產(chǎn)后大鼠隨機(jī)分為產(chǎn)益康栓組(產(chǎn)益康栓納陰道0.4g·kg-1·d-1)、光照組(25 W白熾燈照射陰道5～10 min)、碘伏組、模型組，每組10只，碘伏組和模型組每日醫(yī)用棉簽分別浸泡碘伏和生理鹽水涂擦陰道1次，連續(xù)8 d。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 基質(zhì)金屬蛋白酶-1，組織金屬蛋白酶抑制物-2的檢測(cè)。末次給藥24 h后取陰道組織，切片常規(guī)脫蠟至水，3%H202處理10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min，將切片置于枸櫞酸緩沖液中，在溫度120℃壓力下，抗原修復(fù)2 min，冷卻后PBS洗3次，每次2 min，加BSA封閉液，置于室溫下20 min，甩去多余液滴，不洗。加配好的一抗室溫下過夜，PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗，PBS洗4次，每次5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封固。鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或胞漿中有棕色顆粒為陽性表達(dá)。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，固定放大倍數(shù)(400倍)及光源強(qiáng)度。取8張免疫組織化學(xué)染色切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野。通過高分辨攝取圖像信號(hào)，測(cè)定灰度值，表達(dá)強(qiáng)弱用平均灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以表示，用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠陰道組織MMP-1、TIMP-2的表達(dá)(表1) 免疫組化定量分析示空白組較碘伏組、光照組MMP-1表達(dá)高，TIMP-2表達(dá)低，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組較碘伏組、光照組，MMP-l表達(dá)低，TIMP-2表達(dá)高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 圖像分析 MMP-1、TIMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞均染成棕黃色，各組MMP-1、TIMP-2表達(dá)主要存在于陰道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞漿和(或)部分細(xì)胞核(圖1，圖2)?？瞻捉M鏡下見陰道組織內(nèi)MMP-1呈棕黃色至棕褐色，彌漫狀分布;實(shí)驗(yàn)組呈淺黃色，分布稀疏;碘伏組、光照組介于其中，并遞減。TIMP-2的表達(dá)與MMP-1的表達(dá)正好相反。

表1 各組大鼠陰道組織MMP-1、TIMP-2的表達(dá)()

表1 各組大鼠陰道組織MMP-1、TIMP-2的表達(dá)()

注:與空白組比較，*P ＜0.01;與碘伏組比較，#P ＜0.01;與光照組比較，△P ＜0.01

圖1 MMP-1免疫組化染色(H·E，×40)

圖2 TIMP-2免疫組化染色(H·E，×40)

3 討論

盆底結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)(exracellular matrix，ECM)主要成分是膠原蛋白和纖連蛋白等，膠原蛋白以I型和Ⅲ型為主。正常盆底結(jié)構(gòu)的維持有賴于盆底結(jié)締組織中的ECM，ECM的合成與降解保持著動(dòng)態(tài)平衡，平衡破壞時(shí)就會(huì)產(chǎn)生以盆底結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鞯呐璧坠δ苷系K，因此，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持正常盆底解剖非常重要，ECM降解是PFD發(fā)生的基礎(chǔ)［3］。MMPs的主要功能有:降解細(xì)胞外基質(zhì)膜有效成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，作用于細(xì)胞外組分或其他蛋白成分而啟動(dòng)潛在的生物功能，直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理過程，其中MMP-1可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原酶，TIMP-2是其抑制劑。生理狀況下，MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶特異性組織抑制物(TIMPs)之間保持動(dòng)態(tài)平衡，保證了體內(nèi)生理狀況下細(xì)胞外基質(zhì)的重建與穩(wěn)定性［4］。而產(chǎn)后，陰道組織、盆底肌肉、神經(jīng)、韌帶、筋膜和血管的損傷，導(dǎo)致盆底膠原蛋白降解，ECM平衡破壞，結(jié)構(gòu)改變，功能障礙。

產(chǎn)益康栓是在遵循中醫(yī)傳統(tǒng)理論的基礎(chǔ)上精心組方而成，藥用:黨參、黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、川芎、桃仁、益母草、血竭、柴胡、升麻，具有活血化瘀，補(bǔ)氣養(yǎng)血，升陽舉陷的功效，臨床療效顯著，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明產(chǎn)益康栓對(duì)產(chǎn)后盆底功能障礙性疾病有預(yù)防及治療作用，其作用機(jī)制與抑制陰道組織中MMP-1表達(dá)，促進(jìn)TIMP-2表達(dá)有關(guān)，盆底功能障礙性疾病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脫肛”、“小便不禁”、“便秘”、“魄門痛”等范疇，瘀血阻滯，氣血兩虛是其主要病機(jī)。MMP-1的活性減弱可能與產(chǎn)益康栓提高TIMP-2抑制作用增強(qiáng)，使其1∶1與MMP-1形成復(fù)合體，抑制MMP-1的活性及其酶原活化，從而造成 MMP-1活性降低，減少膠原降解有關(guān)［5］。方中黨參、黃芪、白術(shù)補(bǔ)氣健脾，當(dāng)歸補(bǔ)血、活血止痛，血竭活血化瘀、斂瘡生肌，桃仁、川芎活血祛瘀、行氣止痛，益母草利水消腫、清熱解毒，柴胡、升麻升陽舉陷。全方共奏活血化瘀，補(bǔ)氣養(yǎng)血，升舉陽氣的功效。通過本實(shí)驗(yàn)探討產(chǎn)益康栓的作用機(jī)制，能夠豐富中醫(yī)藥預(yù)防及治療盆底功能障礙的手段和方法。

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