反式白藜蘆醇聯(lián)合胡椒堿對慢性應激大鼠的抗抑郁作用及其下丘腦相關機制

趙樂萍，林蒙蒙，邵 拓，潘建春

(1.溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325035;2.溫州醫(yī)學院附屬樂清醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325600)

白藜蘆醇(resveratrol，REV)是一種多酚類化合物，是虎杖的主要化合物，也富含于紅葡萄皮及紅酒中;為脂溶性物質，易通過血腦屏障，具抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老，預防神經(jīng)退行性疾病等作用，傳統(tǒng)中醫(yī)中用于精神緊張和躁狂-抑郁癥等疾病的治療，因此獲得廣泛關注［1-4］。胡椒堿(piperine，PIP)是“香料之王”胡椒的主要活性化學物質，具抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用，對慢性應激誘導的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA 軸)功能失調(diào)也有一定的調(diào)節(jié)作用。同時PIP是一種生物活性增強劑，與多酚類化合物合用時可明顯提高多酚類化合物的生物利用度，使低劑量的多酚類化合物表現(xiàn)出較強的藥理活性［5］。前期研究顯示，REV具抗抑郁作用，其機制涉及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)系統(tǒng)［6］;有研究指出PIP具有較強的抗抑郁活性，其機制可能與腦單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)活性有關［7］。此外，胡園等［8］認為，PIP 抗抑郁作用可能與其對HPA軸的影響有關。

慢性應激模型可模擬環(huán)境誘因，使動物出現(xiàn)與抑郁癥患者相似的行為及生理學改變，是近年應用最廣泛的抑郁動物模型之一［9］。開野實驗及穿梭箱實驗是較經(jīng)典的抑郁行為學模型，常用于檢驗和篩選抗抑郁藥物。此外，動物穿梭箱實驗中的行為缺失與HPA軸功能障礙相關［10］。

當機體長期處于應激狀態(tài)，HPA軸功能持續(xù)亢進，其負反饋調(diào)節(jié)功能被抑制，機體就會出現(xiàn)抑郁癥狀。單胺遞質神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是5-HT系統(tǒng)，是臨床抗抑郁藥物的主要作用機制。5-HT等遞質減少時，下丘腦促腎上腺皮質釋放因子的釋放減少，HPA軸功能降低，容易出現(xiàn)抑郁、自殺、各種慢性疼痛、強迫行為和焦慮驚恐發(fā)作等;而HPA軸亢進時，可促使皮質醇升高能誘導肝產(chǎn)生色氨酸吡咯化酶，降解血液中的色氨酸。色氨酸是5-HT的前體，其降低可導致5-HT合成不足［11-12］，從而引起抑郁癥及其相關癥狀。此外，皮質類固醇可通過影響糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體的比例來調(diào)節(jié)5-HT的功能［13］。

本研究首先比較了反式REV單用及與低劑量PIP 2.5 mg·kg-1合用在慢性應激大鼠穿梭箱實驗中的藥理學作用。然后采用開野實驗及穿梭箱實驗觀察REV合用PIP后的抗抑郁作用，神經(jīng)化學分析法檢測下丘腦中單胺類物質水平及MAO活性，檢測血清皮質酮含量，探討反式REV與PIP合用的抗慢性抑郁作用機制是否涉及HPA軸。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

反式 REV、PIP、氟西汀(fluoxetine，F(xiàn)LU)、二氫溴犬脲胺(kynuramine dihydrobromide)、4-氫喹啉(4-hydroquinoline)、司立吉林(selegiline;MAO-B抑制劑)、氯吉林(clorgiline;MAO-A 抑制劑)、5-HT、去甲腎上腺素 (norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)、5-羥 吲 哚 乙 酸 (5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)和二羥苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)均購自美國Sigma公司。嗎氯貝胺(moclobemide，MAO-A特異性抑制劑)和羧甲纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium)由中國藥品生物制品檢定所。皮質酮試劑盒購自R＆D公司。反式REV和PIP溶于0.5%羧甲纖維素鈉。嗎氯貝胺和氟西汀溶于雙蒸水。預實驗中，0.5%羧甲纖維素鈉和雙蒸水對大鼠行為學結果的影響沒有明顯差異。因此，正式實驗選擇0.5%羧甲纖維素鈉作為空白對照。

1.2 實驗儀器

WH-966漩渦混合器，太倉市科教器材廠;動物行為學分析系統(tǒng)，上海吉量軟件科技有限公司;BS-11OS型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司;JY92-2D超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;64R超速冷凍離心機，Beckman Coulter公司;超低溫保存箱，海爾公司;970CRT型熒光分光光度計:美國PerkinElmer公司;Bio-Rad 680酶標儀，美國伯樂公司;Agilent 1100高效液相儀，美國Agilent公司;ANTEC電化學檢測器，荷蘭安泰克公司;Anke 80-2C臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 動物分組和慢性應激模型的制備［14］

雄性SD大鼠，二級，體質量200～250 g，購自溫州醫(yī)學院實驗動物中心〔SYXK(浙2010-0150)〕，室溫21℃ ～23℃，濕度40% ～60%，自然光照，自由攝食飲水。所有大鼠先于飼養(yǎng)環(huán)境中適應5 d。大鼠隨機分組，每組8只:即正常對照組，模型組，REV 5，10，20，40，80 mg·kg-1(ig)組，PIP 2.5 mg·kg-1(ip)+反式 REV 2.5，5，10，20，40 mg·kg-1(ig)組，F(xiàn)LU 10 mg·kg-1(ig)組和嗎氯貝胺 20 mg·kg-1(ig)組。嗎氯貝胺組用于MAO活性的測定，除正常對照組和嗎氯貝胺組外，其余各組大鼠均進行造模，即每天給予大鼠1～2種應激，包括禁食24 h，禁水24 h，室溫強迫游泳15 min，過夜光照(36 h)，傾斜45°，換籠孤養(yǎng)24 h，束縛6 h等。造模期間按照分組給予相應藥物，正常對照組和模型組給予0.5%羧甲纖維素鈉，連續(xù)21 d。第22天進行行為學檢測(開野和穿梭實驗)，檢測前禁食12～16 h，飲水自由。行為學結束后處死大鼠，取全血5～10 ml，室溫放置20 min后1000×g離心10 min，取血清，-20℃凍存?zhèn)溆?分離大鼠腎上腺，稱重并計算腎上腺指數(shù)，即腎上腺與大鼠體質量的比值(mg·kg-1);分離大鼠下丘腦，稱重并置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠開野實驗［15］

正方形開野實驗箱為80 cm×80 cm×75 cm，底板用筆畫成10 cm×10 cm的方格，其正上方距離底板90 cm高處有一60 W白熾燈泡。測試時將大鼠置于開野箱中央，適應5 min，隨后觀察10 min內(nèi)大鼠爬格次數(shù)、探究次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上的次數(shù))、理毛次數(shù)和糞便粒數(shù)。

1.5 穿梭箱實驗記錄逃避失敗次數(shù)［16］

將大鼠置于穿梭箱的一端，適應測試環(huán)境3 min。然后進行30次回避實驗:每次實驗前4 s均出現(xiàn)噪聲及光照信號，若此期間無回避反應發(fā)生，大鼠將受到0.8 mA足部電擊;若電擊4 s后仍然無逃避反應發(fā)生，則電擊和光照信號將終止。記錄大鼠在整個實驗中逃避失敗次數(shù)，即電擊出現(xiàn)4 s期間大鼠未到達另一端箱子的次數(shù)。逃避失敗次數(shù)抑制率(%)=(模型組逃避失敗次數(shù)-藥物組逃避失敗次數(shù))/模型組逃避失敗次數(shù)×100%，并采用Logit法計算ED50。

1.6 高效液相電化學法(HPLC-ECD)測定大鼠下丘腦單胺遞質水平［17］

每100 mg腦組織中加入200 μl冰冷 A液(HClO40.4 mol·L-1)，冰浴中超聲勻漿，4℃ 避光靜置60 min，離心20 min(4500 × g，4℃)，取上清液，加入半量體積的B液(檸檬酸鉀0.2 mol·L-1，K2HPO40.3 mol·L-1和 EDTA 0.2 mol·L-1)，渦漩混勻 10 min，4℃避光靜置60 min，再次離心(4500 ×g，4℃)，取上清液過濾，HPLC-ECD測定其單胺遞質水平。取20 μl自動進樣，色譜柱為Diamonsilim C18(長150 mm×內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm)，流動相組成:枸櫞酸-檸檬酸鈉緩沖液125 mmol·L-1(pH=4.3)，EDTA 0.1 mmol·L-1，辛烷基磺酸鈉 1.2 mmol·L-1，16% 甲醇。流速:1.0 ml·min-1。檢測器工作電壓分別為:50，100，200，300，400和500 mV。單胺及其代謝產(chǎn)物的含量以ng·g-1濕組織表示。

1.7 熒光分光光度法測定大鼠下丘腦單胺氧化酶活性

根據(jù)小鼠的檢測方法［18］進行適度改良。分離出的腦組織稱重后加入冰冷磷酸緩沖液(pH=7.8，0.05 mol·L-1)2 ml制成勻漿液。然后在 2.5 ml磷酸緩沖液中加入0.4 ml 20%Triton和0.2 ml組織勻漿液，混勻后預孵育(37℃，10 min)，加入 1 μmol·L-1的司立吉林(MAO-B抑制劑)或氯吉林(MAO-A抑制劑)抑制相應的 MAO，再加入 30 μl終濃度為22 μmol·L-1的底物，37℃孵育 30 min，反應液中加入0.2 ml高氯酸 5 mol·L-1溶液終止反應，冷卻并離心(1500 × g，10 min)，取上清液0.5 ml，加入2.5 ml氫氧化鈉 1 mol·L-1。通過熒光分光光度計在激發(fā)光318 nm，發(fā)射光380 nm處測定產(chǎn)物4-氫喹啉的熒光強度。MAO活性以nmol·g-1蛋白表示。采用Bradford法測定蛋白含量。該實驗中用MAO-A特異性抑制劑嗎氯貝胺做為檢測藥物對MAO-A抑制功效的陽性對照藥。檢測當天，嗎氯貝胺組大鼠ig給予嗎氯貝胺20 mg·kg-1，并在1 h后處死大鼠取下丘腦，檢測MAO活性。

1.8 雙抗體夾心ELISA法檢測血清皮質酮水平

依照試劑盒說明書操作，即先將已知濃度的標準品用樣品稀釋液倍比稀釋，制備標準曲線。然后將標準品與血清樣品加入包被有抗大鼠皮質酮單抗的酶標板上，每孔 100 μl，混勻，37℃孵育 2 h，使標準品與血清樣品中的皮質酮與抗體充分結合;去液并甩干，加入生物素化的抗大鼠皮質酮抗體，每孔100 μl，混勻，37℃孵育 1 h，形成連接與板上的免疫復合物;去液并甩干，洗板3次，甩干，再加入辣根過氧化物酶標記的抗生鏈親和素(streptavidin)，每孔100 μl，混勻，37℃孵育 1 h;去液并甩干，洗板 5 次，甩干，然后每孔加入酶底物90 μl，37℃避光顯色至標準孔出現(xiàn)明顯梯度藍色(15～30 min)，每孔加50 μl硫酸 2 mol·L-1終止，顏色由藍色變?yōu)辄S色，在450 nm處測吸光度(A)值，皮質酮濃度與A值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中皮質酮濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 反式白藜蘆醇及與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠在開野實驗中行為表現(xiàn)的影響

開野實驗結果表明，與正常組相比，模型組的爬格數(shù)(圖1A)和探究活動次數(shù)(圖1B)顯著降低，理毛次數(shù)(圖1C)及糞便粒數(shù)(圖1D)增加。給予PIP 2.5 mg·kg-1+反式REV 20 和40 mg·kg-1組爬格數(shù)和探究活動次數(shù)增加，理毛次數(shù)及糞便粒數(shù)降低，與FLU 10 mg·kg-1作用效果相當。

Fig.1 Effect of trans-resveratrol(trans-REV)combined with piperine on stressed rats in the open field test.Rats were exposed to the various stresses for 21 d except the ones in the normal control group，and all of the rats were provided with drugs once a day for 21 d.REV 2.5-40 mg·kg-1(ig)and piperine 2.5 mg·kg-1(ip)were given in combination.Fluoxetine(FLU)10 mg·kg-1was given ip.And on the 22nd day，rats were exposed to the open field test.The number of crossing，rearing，grooming and dejection amounts were recorded.，n=8.*P＜0.05，compared with normal control group;#P＜0.05，##P ＜0.01，compared with model group.

2.2 反式白藜蘆醇單用及合用胡椒堿后在穿梭箱實驗中的ED50值

在穿梭箱實驗中，單獨ig給予反式REV 5，10，20，40 和 80 mg·kg-1的抑制率分別為 8.1%，18.0%，25.7%，33.2% 和 38.7%，ED50為192.0 mg·kg-1，而 反 式 REV 2.5，5，10，20 和40 mg·kg-1與 PIP 2.5 mg·kg-1聯(lián)合給藥后的抑制率分別為11.7%，21.8%，28.8%，36.6% 和48.6%，ED50降低到49.1 mg·kg-1(見表 1)。

Tab.1 ED50value of trans-REV alone and its combination with piperine(PIP)on stressed rats in shuttle-box test

2.3 反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠在穿梭箱實驗中逃避失敗次數(shù)的影響

圖2結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠的逃跑失敗次數(shù)顯著增加，分別給予PIP 2.5 mg·kg-1+反式REV 10，20和40 mg·kg-1后可顯著降低逃避失敗次數(shù)，作用類似于經(jīng)典抗抑郁藥FLU。

Fig.2 Effect of trans-REV combined with piperine on number of failure escape of stressed rats.See Fig.1 for the treatments.And on the 22th day，rats were exposed to the shuttle-box test，and the number of failure escape was recorded.，n=8.＊＊P＜0.01，compared with the normal control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01，compared with model group.

2.4 反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠下丘腦單胺遞質及其代謝產(chǎn)物含量的影響

如表2中顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠下丘腦中5-HT水平顯著降低，5-HIAA/5-HT水平相對提高，給予 PIP 2.5 mg·kg-1+反式 REV 40 mg·kg-1后，5-HT 水平增加，而 5-HIAA/5-HT 水平則下降。其作用與FLU相當。各組多巴胺及其代謝產(chǎn)物二羥苯乙酸的水平均無顯著差異。

Tab.2 Effect of trans-REV combined with piperine on concentrations of monoamines and their metabolites in hypothalamus of stressed rats

2.5 反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠下丘腦單胺氧化酶活性的影響

與模型組比較，給予反式 REV 40 mg·kg-1+PIP 2.5 mg·kg-1，大鼠下丘腦中 MAO-A 和 MAO-B活性被明顯抑制(表3)。MAO-A特異性抑制劑嗎氯貝胺 20 mg·kg-1顯著抑制 MAO-A的活性，對MAO-B的活性無影響。而經(jīng)典抗抑郁藥FLU對MAO活性無明顯影響。

Tab.3 Effect of trans-REV combined with piperine on monoamine oxidase(MAO)activities in hypothalamus of stressed rats

2.6 白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠腎上腺的影響

如表4所示，與正常大鼠相比，大鼠在經(jīng)歷21 d慢性應激后，腎上腺指數(shù)明顯提高，聯(lián)合給予PIP和反式REV可以顯著逆轉這個趨勢，尤其以反式REV20 和40 mg·kg-1組顯著(P ＜0.01)，效果類陽性對照藥FLU。

Tab.4 Effect of trans-REV combined with piperine on adrenal gland index in stressed rats

2.7 反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對應激大鼠血清皮質酮含量的影響

如表5所示，模型組大鼠的血清皮質酮含量明顯高于正常對照組，而聯(lián)合給予反式REV和PIP可以降低皮質酮含量，REV 10，20和40 mg·kg-1組差異顯著(P＜0.05)。與模型組相比，陽性對照藥FLU也可顯著降低大鼠血清皮質酮含量(P＜0.01)。

Tab.5 Effect of trans-REV combined with piperine on blood serum corticosterone level in stressed rats

3 討論

本實驗結果顯示，反式REV和PIP聯(lián)用后的ED50值顯著下降，從192.0mg·kg-1降到49.1 mg·kg-1，說明 PIP 2.5 mg·kg-1可以提高反式REV的藥理學活性，這可能與PIP抑制肝藥酶活性的作用相關。因而本研究進一步探討反式REV與PIP 2.5 mg·kg-1合用的抗抑郁功效及其可能作用機制。

本研究結果顯示，大鼠經(jīng)21 d慢性不可預知性應激后，在開野實驗中的爬格數(shù)和探究次數(shù)明顯降低，理毛次數(shù)及糞便粒數(shù)顯著增加;穿梭箱實驗中的主動逃避電擊失敗次數(shù)增加。說明慢性應激使大鼠食欲減退、活動能力下降、緊張程度增加、興趣喪失、認知和記憶能力減退，這些表現(xiàn)與抑郁癥患者表現(xiàn)出的精神運動性抑制、興趣改變等具有相似性。給予PIP+反式REV 20和40 mg·kg-1可改善應激引起的大鼠在開野實驗和穿梭實驗中的行為改變，證明了反式REV合用PIP可能具有抗抑郁樣作用。

下丘腦被認為是情緒的軀體反應和內(nèi)臟反應的整合部位，具有直接或間接影響情緒表達的功能，調(diào)節(jié)愉快反應和快感行為，其功能障礙與抑郁癥患者快感缺失、動力下降相關［19］。

5-HT是一種重要的中樞神經(jīng)遞質，參與多種行為、情緒活動的調(diào)節(jié)，在抑郁癥的病因以及抗抑郁藥物的機制研究中至關重要。增強5-HT的神經(jīng)傳遞是抗抑郁藥治療不同類型抑郁癥的共同機制。本研究結果顯示，PIP+反式REV 40 mg·kg-1顯著逆轉應激引起的下丘腦中5-HT水平的下降及5-HT轉換率5-HIAA/5-HT水平的提高。MAO-A主要氧化降解去甲腎上腺素和5-HT;而MAO-B主要氧化降解多巴胺和兒茶酚胺等;MAO特異性抑制劑可用于一些神經(jīng)精神疾病的治療，如抑郁癥等。結果顯示，反式REV在劑量為40 mg·kg-1時可抑制MAO活性，其藥理功效類似MAO-A特異性抑制劑嗎氯貝胺。嗎氯貝胺可抑制MAO-A活性，使5-HT含量增加，5-HT轉換率呈下降趨勢。因此，REV合用PIP可能通過抑制MAO活性，尤其是抑制MAO-A活性，提高下丘腦中5-HT水平而發(fā)揮作用。這與已有報道指出的反式REV［6］和PIP［7］具有MAO活性抑制作用而發(fā)揮抗抑郁作用一致。

穿梭箱實驗中的行為缺失與HPA功能障礙緊密相關［10］，本研究中反式REV和低劑量PIP合用顯著改善應激大鼠在穿梭箱實驗中的行為缺失，促使我們進一步探討其抗抑郁作用是否涉及HPA軸。臨床研究表明，抑郁癥患者的HPA軸功能亢進;抑郁癥患者的唾液、血漿及尿液等代謝產(chǎn)物中皮質酮水平增高，失去夜間自發(fā)性分泌抑制的節(jié)律;垂體和腎上腺的體積增大［20］。而這種功能亢進和抑郁癥具有一定的依賴性，隨著抑郁的恢復，HPA軸的功能也逐步恢復正常［21］。Rubin等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的腎上腺皮質增生約38%，增生的程度與皮質醇有關;隨著抑郁癥狀的緩解，這種增生也似乎隨著皮質醇的正常化而逐步消失，這與HPA軸的慢性或持續(xù)活躍有關［23］。也有報道指出不管是臨床抑郁癥患者還是慢性應激大鼠，都表現(xiàn)出HPA軸負反饋功能抑制［24-25］，并且這種HPA軸功能異常以血清皮質酮升高和腎上腺增生為特征［26］。本研究結果顯示，大鼠經(jīng)21 d慢性綜合性應激后，腎上腺指數(shù)上升，說明慢性應激對HPA軸活動產(chǎn)生影響并致使腎上腺皮質出現(xiàn)增生;此外，本研究中慢性應激引起的HPA軸亢進，還表現(xiàn)為血清皮質酮水平的顯著增加，而反式REV合用PIP可顯著逆轉這些現(xiàn)象。因此，推測本研究中大鼠腎上腺的增生與大鼠血清皮質酮含量增加緊密相關，且均由慢性應激引起的HPA軸失調(diào)導致。

HPA軸與5-HT系統(tǒng)間存在著廣泛的相互作用。5-HT等遞質減少時，下丘腦促腎上腺皮質釋放因子的釋放減少，HPA軸功能降低;HPA軸亢進時，則促使皮質醇升高而誘導肝產(chǎn)生色氨酸吡咯化酶，降解血液中的色氨酸而導致5-HT合成不足［11-12］，從而引起抑郁癥及其相關癥狀。此外，HPA軸系統(tǒng)紊亂導致的皮質激素水平升高，可以通過海馬中糖皮質激素受體調(diào)節(jié)縫核-海馬系統(tǒng)5-HT神經(jīng)元活性，引起5-HT傳導系統(tǒng)，尤其是5-HT1A受體傳導功能受損，而5-HT1A受體與抑郁癥密切相關。徐英等［27］指出，姜黃素的抗抑郁作用很可能與增加海馬中糖皮質激素受體和5-HT1A受體的表達，維持應激狀態(tài)下HPA軸的穩(wěn)定有關。單胺神經(jīng)遞質水平降低是抑郁發(fā)生機制中的第一步，也是抑郁癥首先導致的結果之一;HPA軸功能異常是應激及情感障礙性疾病導致整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的生理基礎。單胺遞質水平的降低與HPA軸功能異?？上嗷ビ绊懚M一步加重單胺遞質的減少和HPA軸負反饋障礙，最終導致嚴重抑郁癥［28］。

綜上所述，反式 REV 和 PIP 2.5 mg·kg-1合用可抑制MAO活性，尤其是MAO-A活性而提高下丘腦中5-HT濃度，降低其轉換率，同時改善因應激引起的HPA軸失調(diào)而表現(xiàn)的腎上腺增生及血清皮質酮異常升高。因此，推測反式REV合用PIP在慢性不可預知性應激抑郁模型中的抗抑郁樣作用涉及調(diào)節(jié)下丘腦中的5-HT遞質系統(tǒng)和HPA軸功能，但其確切的作用靶點需在生物分子及基因水平上對該信號通路進行檢測。此外，本研究中指出，PIP 2.5 mg·kg-1可以提高反式REV的藥理學活性，但本研究并沒有研究反式REV和PIP合用是否具有協(xié)同抗抑郁作用，但不排除兩藥合用具有協(xié)同作用，若要進一步研究反式REV和PIP聯(lián)合作用的性質需采用等效線法進行檢驗。

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