槲皮素對糖尿病大鼠腎臟組織的保護作用及其調(diào)控機制的研究

周方敏 來 芳 黃振步

糖尿病腎病(DN)是指糖尿病微血管病變導致的腎小球硬化，又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是引起終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。研究表明，周期素激酶抑制劑P27增多在DN腎功能損害中起重要作用[1]。槲皮素作為具有多種生物活性的黃酮類化合物，對糖尿病和慢性腎衰竭大鼠腎功能具有保護作用，可減少糖尿病大鼠的蛋白尿[2-3]，但機制不甚明確。為了進一步探求槲皮素對DN的保護作用機制及進一步明確P27在腎小管上皮細胞表達的意義，本研究擬對槲皮素對DN腎小管上皮細胞表達P27的影響進行體外研究。報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 鏈脲佐菌素和槲皮素均為美國Sigma公司產(chǎn)品；鹽酸貝那普利為北京諾華有限公司產(chǎn)品(批號：X1036)；大鼠抗P27多克隆抗體(產(chǎn)品編號：BA0273)、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；即用型免疫組化Elivision TM plus試劑盒(產(chǎn)品編號：KIT-9901)、EDTA抗原修復(fù)液(產(chǎn)品編號：MVS-0098)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實驗動物 健康SD大鼠，雄性，清潔級，體重180～200g，50只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗期間，動物房室溫控制在25～28℃，濕度45%，明暗周期12h/12h。

1.3 實驗動物模型制備及分組 參考Yokozawa等[4]報道的方法制備模型：用0.3%戊巴比妥鈉溶液以1ml/100g腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮消毒，從距左脊肋骨1.5cm處作斜向外方切口背部切口，長約2cm，逐層剪開皮膚、肌肉、筋膜，暴露左腎，剝離腎包膜，止血鉗夾住腎動脈、輸尿管并結(jié)扎，剪下左腎，分層縫合腹膜、肌肉、皮膚，并在傷口處滴0.01ml慶大霉素，以預(yù)防術(shù)后傷口感染。2周后，按55mg/kg單次腹腔注射鏈脲佐菌素。72h后尾尖取血，測空腹血糖，將血糖≥16.7mmol/L、尿量大于對照組的50%作為糖尿病腎病動物模型建立標準，成功制備40只模型大鼠。分組:①假手術(shù)組(SO組，n=10)，SO組只暴露左側(cè)腎臟后再放回腹腔，關(guān)閉腹腔，分層縫合;②模型組(M組，n=10);③槲皮素組(Q組，n=10):槲皮素100mg/(kg·d)灌胃;④鹽酸貝那普利組(B組，n=10):鹽酸貝那普利20mg/(kg·d)灌胃。假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水，連續(xù)給藥共8周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 體重、腎重及腎重/體重比 每周稱量體重，觀察并記錄，取材時稱腎重，并計算腎臟肥大指數(shù)[KHI＝右側(cè)腎重(g)/體重(g)]。

1.4.2 尿微量白蛋白和β2-微球蛋白 代謝籠中收集24h尿液標本，采用ELISA法檢測尿微量白蛋白和β2-微球蛋白。

1.4.3 生化指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮、肌酐水平。

1.4.4 腎臟組織形態(tài)學檢查 取同一腎組織，常規(guī)固定，石蠟切片，HE染色，在普通光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學改變情況。

1.4.5 免疫組織化學法檢測P27的表達 取同一腎組織，采用Elivison二步法，按試劑盒說明書要求操作。結(jié)果判斷：免疫組織化學方法染色后，將所制切片在光學顯微鏡下觀察，細胞核/胞漿呈現(xiàn)明確的黃色或棕黃色染色為陽性表達，細胞核藍染的為蘇木素復(fù)染的陰性細胞。在200倍鏡下，用圖像分析系統(tǒng)測量其吸光度值，每張切片隨機檢測5個視野，然后計算出平均吸光度值，以平均吸光度值作為P27表達水平的半定量參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎重、腎肥大指數(shù)的情況(表1)由表1可見，與SO組相比，M組、Q組、B組的腎重明顯增加(t值分別為5.72、5.87、6.01，P＜0.01)，腎肥大指數(shù)亦明顯增加(t值分別為13.60、10.14、9.31，P＜0.01)，提示模型制備成功；與M組相比，Q組、B組的腎重較輕，但差異不明顯(t值分別為0.45、0.26，P＞0.05)，腎肥大指數(shù)明顯減小(t值分別為3.16、2.56，P＜0.05)。

表1 各組大鼠腎重、腎肥大指數(shù)的比較 ±s)

表1 各組大鼠腎重、腎肥大指數(shù)的比較 ±s)

組 別 例數(shù)(只)腎重(g)腎肥大指數(shù)SO組 10 1.48±0.28 2.93±0.53 M組 10 2.58±0.54 9.69±1.48 Q組 10 2.48±0.46 7.67±1.38 B組 10 2.52±0.47 7.92±1.61

2.2 各組大鼠β2-微球蛋白和尿微量白蛋白情況(表2)由表2可見，與SO組相比，M組、Q組、B組的β2-MG水平升高(t值分別為13.41、10.05、9.33，P＜0.01)，UAlb水平亦明顯升高(t值分別為6.90、2.50、2.62，P＜0.05);與M組相比，Q組、B組的β2-MG明顯下降(t值分別為3.78、3.48，P＜0.01)，UAlb水平亦明顯下降(t值分別為4.15、3.97，P＜0.01)。

表2 各組大鼠β2-MG、UAlb的比較 ±s)

表2 各組大鼠β2-MG、UAlb的比較 ±s)

組 別 例數(shù)(只)β2-MG(μg/24h)UAlb(μg/24h)SO組 10 115.38± 36.28 3.96±1.32 M組 10 756.25±146.68 9.82±2.34 Q組 10 526.53±124.20 5.82±1.95 B組 10 534.82±137.42 5.95±2.01

2.3 各組大鼠Scr、BUN的情況(表3)由表3可見，與SO組相比，M組、Q組、B組的Scr水平升高(t值分別為14.01、7.36、8.59，P＜0.01)，BUN水平亦明顯升高(t值分別為8.62、7.14、8.52，P＜ 0.01)。與M組相比，Q組、B組的Scr水平下降(t值分別為4.91、4.71，P＜0.01)；與M組相比，Q組BUN水平下降明顯(t=2.51，P＜0.05)，而B組BUN水平下降不明顯(t=1.63，P＞0.05)。

表3 各組大鼠Scr、BUN的比較 (±s)

表3 各組大鼠Scr、BUN的比較 (±s)

組 別 例數(shù)(只)Scr(μ mol/L)BUN(mmol/L)SO組 10 28.80±3.45 7.41±1.32 M組 10 56.90±5.32 15.48±2.65 Q組 10 44.62±5.86 12.84±2.01 B組 10 45.80±5.22 13.78±1.96

2.4 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學的情況 光鏡下觀察：SO組見腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見增大及萎縮，球囊壁光滑，細胞外基質(zhì)與系膜細胞分布正常，毛細血管腔清晰，系膜細胞無增生，基底膜無增厚。模型組腎小球面積增大，腎小球腫脹，腎小囊變窄，基底膜增厚，系膜增寬，系膜細胞增生，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)肥大、空泡變性，管腔變窄，部分小血管玻璃樣變性。B組和Q組亦出現(xiàn)上述病理改變，但與模型組相比均有不同程度的減輕。

2.5 各組大鼠P27表達的比較(表4)由表4可見，與SO組相比，M組P27表達明顯增加(t=7.71，P＜0.01)，Q組、B組P27表達增加不明顯(t值分別為1.65、1.88，P＞0.05)；與M組相比，Q組、B組的P27表達明顯下降(t值分別為3.59、3.63，P＜0.01)。

表4 各組大鼠P27表達的比較 ±s)

表4 各組大鼠P27表達的比較 ±s)

組別 例數(shù)(只)P27 S0組 10 2.72±0.48 M組 10 5.56±1.06 Q組 10 3.52±1.45 B組 10 3.58±1.36

3 討論

DN是糖尿病最常見的嚴重微血管并發(fā)癥，是糖尿病死亡的主要原因之一。大量的臨床研究均證實血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥可用于治療DN，對糖尿病患者腎臟起到保護作用，可以延緩其腎功能的進一步惡化[5]。故本次研究以ACEI的代表藥物——貝那普利作為對照，探討槲皮素對DN的治療作用及其機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

腎臟肥大是DN早期的特征性改變，也是預(yù)示后期腎功能減退的一個形態(tài)學指標。腎臟肥大主要是指腎臟體積增大，包括腎小球體積增大和腎小管細胞肥大，尤以后者為著，約占整個腎臟體積的90%。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，高血糖、腎臟血流動力學的紊亂均可以刺激腎臟固有細胞，通過各種方式合成及釋放相關(guān)細胞因子，影響腎臟固有細胞的增殖周期和細胞外基質(zhì)(ECM)的合成，腎臟細胞肥大主要與周期素激酶抑制劑P27表達關(guān)系密切。

P27是一種分子量為27KD的熱穩(wěn)定蛋白，屬于非特異性激酶抑制劑(CKI)家族一員，可抑制許多不同的Cyclins/CDK復(fù)合物的活性，使細胞不能通過G1期，G1期過度延長抑制細胞增殖，而對細胞周期進行調(diào)控。P27水平的高低對細胞是處于靜止期或進入細胞周期具有重要的作用。在細胞增殖過程中，P27是細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過程的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，P27對腎臟細胞增殖、肥大、分化、凋亡等均具有重要的調(diào)控作用[7]，糖尿病高血糖狀態(tài)刺激并上調(diào)P27表達，由于細胞中周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑P27表達的增加，可結(jié)合并滅活G1期時相相應(yīng)細胞周期素與CDK復(fù)合物，導致CDK活性下降，阻止G1期向S期轉(zhuǎn)變，細胞分裂停滯于G1期，表現(xiàn)為細胞蛋白質(zhì)/DNA比值病理性增高、細胞肥大、ECM合成增多、基膜增厚，繼而導致腎小球硬化、腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化等一系列不可逆病理改變。因此，調(diào)控P27功能可明顯減輕糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

本文結(jié)果顯示，P27陽性細胞主要為胞漿呈棕褐色，假手術(shù)組P27陽性表達較少，模型組P27陽性表達明顯增多，結(jié)合模型組高血糖、腎重大、腎臟肥大指數(shù)高，提示高糖刺激下P27表達增加，已知P27為CKD制性蛋白，可直接抑制多種CDK表達和活性，而P27的過強表達使細胞停頓于G1期，引起蛋白合成增加，從而致早期糖尿病腎病的細胞周期停頓及細胞肥大。因此，推斷糖尿病腎病早期腎臟肥大至少部分與腎皮質(zhì)P27蛋白表達增加有關(guān)，說明P27是一種十分重要的細胞周期負調(diào)節(jié)蛋白，與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在糖尿病腎病大鼠腎損害中起重要作用。與模型組相比，槲皮素組P27表達明顯減少，結(jié)合腎重、腎臟肥大指數(shù)等指標，提示槲皮素可能通過抑制P27的表達，從而減弱對CKD活性的抑制，促使細胞越過S期而逆轉(zhuǎn)細胞肥大。由此推斷，通過下調(diào)P27表達，抑制腎臟細胞的過度增殖與肥大，進而減少ECM分泌，延緩DN的進展，從而發(fā)揮腎保護作用可能是槲皮素防治糖尿病腎病的機制之一。

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