苯磺隆降解菌生長條件研究

王惟帥，吳濟南，張?zhí)鞂?，杜慧?/p>

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

苯磺?。═ribenuron-methly）是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型磺酰脲類除草劑，于20世紀80年代由美國杜邦公司開發(fā)，具有高效、廣譜、低殘留、用量少等優(yōu)點，是目前廣泛用于麥田雜草防治的除草劑之一。苯磺隆曾被認為是一種易降解且在生態(tài)環(huán)境中無殘留的農(nóng)藥[1-2]。然而，后來有研究發(fā)現(xiàn)，由于其對光、熱穩(wěn)定以及長期大量使用，給環(huán)境造成了土壤—水體—生物—大氣各層面直接、復(fù)合交叉和循環(huán)式的立體污染，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡造成不利影響[3]。利用微生物代謝多樣性的特點對受污染土壤進行生物修復(fù)，是解決農(nóng)藥污染的重要途徑[4-6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于苯磺隆的研究主要集中在藥效、殘留分析方法及其對植物生理特性的影響等方面[7-10]。而苯磺隆的生物降解以及苯磺隆降解菌生物學(xué)特性的研究鮮見報道[11-13]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室從長期使用苯磺隆的污染土壤中，分離得到1株苯磺隆降解菌株，命名為BHL。本試驗以其為研究對象，進行生長條件特性的研究，旨在為苯磺隆降解菌的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基（MM）組成為 ：MgSO4·7H2O 0.2 g/L；FeCl30.05 g/L；K2HPO41.0g/L；KH2PO41.0g/L；NaCl0.5g/L；CaCl20.02 g/L；NH4NO31.0 g/L；pH 值 7.0～7.5。

1.1.2 供試菌株和農(nóng)藥 苯磺隆降解菌株BHL由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室分離獲得，苯磺隆原藥（純度95%）由中國沈陽化工研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株生長量測定 降解菌株經(jīng)無菌水洗滌2次后，接種于無機鹽培養(yǎng)基（pH值7.0）中，使菌濃度達106個/mL，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。定時取樣，于OD600測定降解菌株BHL的生長情況。3次重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)基初始pH值和Mg2+質(zhì)量濃度對菌株BHL生長的影響 分別以初始pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 和 Mg2+質(zhì)量濃度 100，200，300，400，500 mg/L為試驗組，將含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基 （菌濃度大約達106個/mL）盛于250 mL三角瓶中，接種經(jīng)活化24 h、磷酸緩沖液洗滌3次的降解菌株BHL后，30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，同1.2.1定時測定菌體的生長量。每個試驗設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對照。

1.2.3 苯磺隆質(zhì)量濃度和溫度對菌株BHL生長的影響 活化24 h的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于初始pH值為7.0，苯磺隆質(zhì)量濃度分別為 50，100，200，300，400，500 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中（菌濃度大約達106個/mL），30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。測溫度的試驗組則將接種好菌株的含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基置于 10，20，30，40，50 ℃的條件下培養(yǎng)，同1.2.1定時測定菌體的生長量。每個試驗設(shè)3次重復(fù)，同時設(shè)置無菌為對照。

1.2.4 通氣量對菌株BHL生長的影響 采用250 mL三角瓶分別盛有含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基 20，30，50，70，90 mL，將活化 24 h 的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于其中，于30℃，150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，定時測定菌體生長量，每個試驗設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對照。菌體生長量測定同1.2.1。

1.2.5 不同氮源、碳源對菌株BHL生長的影響

活化24 h的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，分別接種于以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆等為唯一氮源和以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，且所選的氮源、碳源質(zhì)量濃度均為100 mg/L（菌濃度大約達106個/mL），30℃，150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，定時測定菌體生長量，每試驗3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對照。菌體生長量測定同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH值對降解菌株BHL生長的影響

從圖1可以看出，在含有苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，pH值在6.5～9.0范圍內(nèi)，菌株BHL均可以生長。不同時間的OD600值隨著培養(yǎng)基初始pH的增加表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢；當pH值為7.0時，OD600最大，說明菌株在pH值為7.0時，生長最佳。

2.2 苯磺隆質(zhì)量濃度對降解菌株BHL生長的影響

由圖2可知，降解菌株BHL在苯磺隆質(zhì)量濃度為50～500 mg/L時均可以生長。除50 mg/L外，其他質(zhì)量濃度處理均在第7天時OD600值達最大；當苯磺隆濃度為100 mg/L時，不同時間的OD600值均為最大，說明菌株在苯磺隆質(zhì)量濃度為100 mg/L時，生長最好。

2.3 溫度對降解菌株BHL生長的影響

從圖3可以看出，降解菌在所設(shè)的溫度條件下均可以生長。隨著溫度的升高，OD600呈先增加后減少的變化趨勢；當溫度為30℃時，菌株長勢最好。

2.4 通氣量對降解菌株BHL生長的影響

由圖4可知，在250 mL的三角瓶中裝入20～90 mL培養(yǎng)液后，菌株BHL均可以生長，但隨著培養(yǎng)基體積的增加，不同時間OD600呈先增加后減少的變化趨勢。當裝液量為50 mL（1/5體積）時，降解菌株BHL的生長最好。

2.5 Mg2+質(zhì)量濃度對菌株BHL生長的影響

從圖5可以看出，降解菌株BHL在供試Mg2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均可以生長。當Mg2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時，生長最佳。

2.6 不同氮源對降解菌株BHL生長的影響

由圖6可知，降解菌株BHL在以尿素、酵母膏、硝酸鈉和苯磺隆分別為唯一氮源的培養(yǎng)基中均可以生長，生長情況視不同氮源而異（酵母膏＞尿素＞苯磺隆＞硝酸鈉）。從圖6可以看出，以酵母膏為氮源時，降解菌株BHL的生長最好，OD600值明顯高于其他幾種氮源。苯磺隆作為唯一氮源時，菌株BHL可以生長，與以尿素、硝酸鈉為氮源時生長狀況差異不大。

2.7 不同碳源對菌株BHL生長的影響

從圖7可以看出，以相同質(zhì)量濃度的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆分別為唯一碳源的培養(yǎng)基中，以葡萄糖為碳源時，降解菌株生長情況較其他碳源要好。在所選碳源的培養(yǎng)基中，降解菌株雖都能生長，但生長情況較差，OD600值都在0.1以下。

3 討論與結(jié)論

土壤中農(nóng)藥的降解途徑，一般分為物理、化學(xué)與生物過程，而微生物降解與化學(xué)水解是其主要降解途徑。土壤環(huán)境中存在多種可以降解農(nóng)藥的微生物。近年來，國內(nèi)外研究者開展了生物強化修復(fù)農(nóng)藥的研究，通過富集培養(yǎng)、分離篩選等技術(shù)已經(jīng)篩選出很多能夠降解農(nóng)藥的微生物，應(yīng)用微生物進行生物修復(fù)已成為環(huán)境修復(fù)的一個主要研究方向。生物修復(fù)技術(shù)主要是利用微生物的降解作用，將污染物分解并最終去除，它具有無毒、無殘留、無2次污染等優(yōu)點。而在修復(fù)過程中，外源降解菌的穩(wěn)定性、活性等因素是影響生物修復(fù)的關(guān)鍵因素。因此，當引入外源降解菌對土壤進行生物修復(fù)時，只有了解降解菌的生物學(xué)特性，才能通過人為調(diào)控的手段來促進、強化生物修復(fù)，為提高農(nóng)藥的生物降解效率提供技術(shù)依據(jù)。有關(guān)磺酰脲類除草劑降解菌生長特性等方面的研究報道相對較少[14-15]。

本試驗對從長期使用苯磺隆的田間土壤中分離得到的苯磺隆降解菌株生長條件優(yōu)化研究表明，苯磺隆降解菌株BHL在pH值為6.5～9.0的范圍內(nèi)均可以生長，但以pH值為7.0時生長最佳；苯磺隆質(zhì)量濃度對菌株BHL的生長有一定的影響，其質(zhì)量濃度為100 mg/L時，菌株BHL生長最好；10～50℃范圍內(nèi)降解菌可以生長，但30℃時生長最好；250 mL三角瓶，裝液量為20～90 mL菌株BHL均可以生長，但裝液量為50 mL時菌株生長狀況最好；Mg2+質(zhì)量濃度為100～500 mg/L的范圍內(nèi)，菌株均可以生長，但當Mg2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時，菌株BHL的生長最佳。以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆為唯一氮源和以100 mg/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，菌株BHL均可以生長，其中，分別以酵母膏為碳源和以葡萄糖為氮源時，生長最好；且以苯磺隆為唯一氮源或碳源菌株都能夠正常生長。

苯磺隆降解菌生長特性的研究，為利用生物手段修復(fù)苯磺隆污染土壤的研究提供了理論基礎(chǔ)，同時為生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

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