1株苯并[a]芘高效降解菌的分離鑒定

弓玉紅，郝 林，郭凱凱

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

苯并[a]芘（BaP）是一種含5個(gè)環(huán)的稠環(huán)芳烴，它是由1個(gè)苯環(huán)和1個(gè)芘分子結(jié)合而成的多環(huán)芳烴類化合物[1]。其分子式為C20H12，分子量為252。在室溫下，其為黃色或淡黃色晶體，熔點(diǎn)179℃，沸點(diǎn)496℃，相對(duì)密度為1.35，易溶于丙酮、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷乙醇、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑，極不易溶于水，這也是其在環(huán)境中難以被降解的原因之一[2]。苯并[a]芘大多是石油、煤炭等化石燃料以及木材、天然氣、汽油、重油、有機(jī)高分子化合物、紙張、作物秸稈、煙草等含碳?xì)浠衔锏奈镔|(zhì)經(jīng)過(guò)不完全燃燒而生成。苯并[a]芘則是一種強(qiáng)致癌物[3]，其不僅存在于石油產(chǎn)品中，而且也存在于食品、大氣和煤焦油中[4]，也容易殘留在土壤中。許多國(guó)家都進(jìn)行過(guò)土壤中BaP含量調(diào)查，殘留濃度取決于污染源的性質(zhì)與距離[5]，公路兩旁的土壤中BaP含量為2.0 mg/kg，在煉油廠附近土壤中為200 mg/kg；被煤焦油、瀝青污染的土壤中，其含量高達(dá)650 mg/kg。農(nóng)作物中的BaP殘留濃度取決于生產(chǎn)地附近是否有工業(yè)區(qū)或交通要道[6]。許多國(guó)家的動(dòng)物試驗(yàn)證明，苯并[a]芘具有致癌、致畸、致突變的特點(diǎn)。苯并[a]芘遇明火、高熱可燃，受高熱分解會(huì)釋放出有毒的氣體，即一氧化碳、二氧化碳、成分未知的黑色煙霧。

本研究在山西太谷縣焦化廠周邊耕地中采集被苯并[a]芘污染的土壤樣品，分離篩選到1株苯并[a]芘降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定，屬于假單胞菌屬，為土壤苯并[a]芘污染的生物修復(fù)提供依據(jù)，以及為降解土壤苯并[a]芘污染微生物多樣性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

土樣采自山西省太谷縣焦化廠周邊耕地耕層土壤。富集用培養(yǎng)基[7]1 L：（NH4）2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，苯并[a]芘 5 mg（溶解于丙酮后加入），加水至1 L，pH值為7.5。2216E培養(yǎng)基1 L：蛋白胨5 g，酵母浸膏1 g，磷酸高鐵 0.01 g，pH值為7.6～7.8。

1.2 苯并[a]芘降解菌分離方法

稱取10 g土樣加入到含有適量玻璃珠的100 mL無(wú)菌水中，振蕩3 h[8-9]。靜置30 min后，移取5 mL上清液到45 mL含有苯并[a]芘質(zhì)量濃度為5 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，25℃，150 r/min搖床避光培養(yǎng)。每隔7 d移取10 mL菌液至滅菌的90 mL無(wú)機(jī)鹽-苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)；連續(xù)富集培養(yǎng)28 d后，移取混合菌液稀釋，涂布于2216E固體平板培養(yǎng)基上分離、純化，觀察單菌落形態(tài)，并采用試管斜面保存菌株[10]，觀察菌株并進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特征鑒定。

1.3 降解菌的鑒定

1.3.1 分離菌株生理生化特征的檢測(cè) 生理生化特征檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.3.2 16 S rDNA測(cè)序的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 菌株總DNA的提?。翰捎肅TAB法提取細(xì)菌的DNA于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)：采用細(xì)菌的16 SrRNA通用引物，以提取的總DNA為模板，對(duì)該菌株的16 S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物和下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，加無(wú)菌水至50μL。反應(yīng)程序：95℃5min；94℃1min，53℃1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行序列搜索比對(duì)后，選擇親緣關(guān)系較近的幾種菌株作為參比菌株，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 苯并[a]芘含量的測(cè)定 在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入丙酮-苯并[a]芘母液，使苯并[a]芘的質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/L。振蕩培養(yǎng)10 d，同時(shí)設(shè)不接菌對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。苯并[a]芘含量采用萃取-紫外分光光度法[11]測(cè)定。培養(yǎng)后向試管中加入環(huán)己烷重復(fù)萃取2次，合并萃取液在50mL容量瓶，定容，用紫外分光光度計(jì)在296 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[1]，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)查出樣品中剩余的苯并[a]芘含量。

1.3.4 苯并[a]芘降解率的計(jì)算 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中剩余苯并芘的含量，然后利用公式c＝（a-b）/a×100%計(jì)算降解率。

其中，c為降解率；a為空白樣品中苯并[a]芘的含量；b為處理后剩余苯并[a]芘的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并[a]芘降解菌的篩選與鑒定

以苯并[a]芘為唯一碳源篩選出1株高效降解菌，該菌株命名為A12，為球狀，革蘭氏染色呈陰性，極生鞭毛。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，對(duì)A12生理生化測(cè)定結(jié)果如表1，表2所示。其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖1所示。

表1 菌株形態(tài)鑒定結(jié)果

表2 菌株生理生化鑒定結(jié)果

菌株A12的16 S rRNA經(jīng)測(cè)序后（NCBI序列號(hào)為AM184213.1），通過(guò)序列搜索和序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株A12與Comamonas sp.DUT_AHX（DQ409079）的同源性最高，同源率為99.93%，Comamonas sp.DUT_AHX是1株睪丸酮叢毛單胞菌，對(duì)硝基苯有降解作用。與Pseudo-monas testosteroni屬的其他菌株（M11224和AB127967）同源率均高于99%以上，而這些菌株對(duì)芳香族化合物均有降解作用?；谏鲜鲂螒B(tài)鑒定、生理生化鑒定和16 S rRNA序列分析結(jié)果，初步確定A12菌株為睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）。

2.2 苯并[a]芘降解率

苯并[a]芘降解標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。從圖2可以看出，苯并[a]芘質(zhì)量濃度在1.0～3.0 mg/L的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。對(duì)樣品的吸光度值進(jìn)行測(cè)定，得出其吸光度值為0.069，對(duì)照為0.135。用標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.424 8x－0.101 6計(jì)算得出，空白樣品中苯并[a]芘的含量（a）為0.557，處理后剩余苯并[a]芘的含量（b）為0.402。利用公式c＝（a－b）/a×100%計(jì)算降解率（c）為28%。綜合得出，菌株A12在苯并[a]芘質(zhì)量濃度為5 mg/L、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為28℃的條件下，振蕩培養(yǎng)12 d，苯并[a]芘的降解率為28%。

3 結(jié)論

以苯并[a]芘為唯一碳源從焦化廠周邊耕地耕層土壤中篩選出1株降解菌A12，經(jīng)鑒定為睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）；菌株A12在苯并[a]芘質(zhì)量濃度5 mg/L、轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度28℃的條件下，振蕩培養(yǎng)12 d時(shí)，苯并[a]芘的降解率為28%。

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