土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的分離、鑒定及提高產(chǎn)酶能力的研究

傅 冰，王東明

（麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境工程分院，浙江 麗水323000）

1 引言

淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一類(lèi)酶的總稱。在淀粉糖工業(yè)和食品工業(yè)中被廣泛利用，是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種[1]。按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分為α－淀粉酶、β－淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶4類(lèi)。目前工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α－淀粉酶[2]，其中枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的淀粉酶極其應(yīng)用處于整個(gè)酶制劑的首位。自然界中具有十分豐富的產(chǎn)淀粉酶菌種資源，本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株，通過(guò)常規(guī)方法結(jié)合18SrDNA序列分析鑒定該菌株。通過(guò)化學(xué)誘變、物理誘變及復(fù)合誘變等方法誘變菌株，進(jìn)一步篩選獲得具有更高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株，為今后獲得能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)淀粉酶菌株奠定了一定的基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

Taq酶、dNTPs、EasyPure Quick膠回收試劑盒、MarkerIII均購(gòu)自TransGen Biotech生物公司；Mastercycle personal PCR 儀 （eppendorf，美 國(guó)）；Dolphlin－DOC Plus凝膠成像系統(tǒng)（Wealtec，美國(guó)）；HWY－100A恒溫?fù)u床（東莞吉之壟電子儀器有限公司）；DHZ－CA恒溫?fù)u床（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；2C40809023－723型分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；XW－80A混勻器（上海棋特分析儀器有限公司）。

平板初篩選及試管斜面保存培養(yǎng)基為胰化蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉2%，瓊脂2%，pH值為7.0；液體復(fù)篩培養(yǎng)基為胰化蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉2%，pH值為7.0；驗(yàn)證有無(wú)組成型突變菌株培養(yǎng)基配方為胰化蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 值為7.0。

2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

2.2.1 篩選產(chǎn)酶菌株的土壤處理

從麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院的花壇地下5～20cm處，獲取熟化、有機(jī)質(zhì)含量高的肥沃土壤，分離菌株。對(duì)土壤做以下幾種處理：不做任何處理為對(duì)照；刮去離地面5cm表土層，翻倒土壤，深度為5cm，邊長(zhǎng)為15cm，面積為225cm2，拌入50g可溶性淀粉；拌勻后，輕拍土壤，上蓋薄膜保濕。培養(yǎng)5d。刮去離地面5cm表土層，翻倒土壤，深度為5cm，邊長(zhǎng)為15cm，面積為225cm2，拌入50g可溶性淀粉、10g蛋白胨，拌勻后，輕拍土壤，上蓋薄膜保濕。培養(yǎng)5d。刮去離地面5cm表土層，翻倒土壤，深度為5cm，邊長(zhǎng)為15cm，面積為225cm2，拌入50g可溶性淀粉、10g硫酸銨，拌勻后，輕拍土壤，上蓋薄膜保濕，培養(yǎng)5d。刮去離地面5cm表土層，翻倒土壤，深度為5cm，邊長(zhǎng)為15cm，面積為225cm2，拌入50g可溶性淀粉、10g硝酸鉀，拌勻后，輕拍土壤，培養(yǎng)5d。

2.2.2 平板初篩菌種

取1g土壤，稀釋106倍，分別取103～106稀釋液涂平板，37℃培養(yǎng)48h，接著用0.1%稀碘液顯色1～2min，挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落挑至斜面上，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)。

2.2.3 液體培養(yǎng)基復(fù)篩測(cè)定淀粉酶活力

制備106個(gè)/mL孢子懸浮液，含40mL液體復(fù)篩培養(yǎng)基150mL三角瓶接種1mL菌懸液或孢子懸浮液，37℃培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速170r/min。以1mL濾液5min內(nèi)水解淀粉生成1μmol還原糖量定義為1個(gè)活力單位（U），3，5－二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，挑選產(chǎn)酶活力最大值的菌株為目的菌株。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)觀察

在平板初篩培養(yǎng)基平板上觀察霉菌的菌落形態(tài)，利用水浸片法在高倍鏡下觀察菌絲體、孢子器及孢子形態(tài)。

2.3.2 18SrDNA鑒定菌種

（1）PCR反應(yīng)擴(kuò)增18SrDNA?；蚪MDNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法[3]，18SrDNA序列擴(kuò)增采用18SrNDA通用引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（電泳強(qiáng)度為5V/cm）檢測(cè)后，利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，交于測(cè)序公司測(cè)定序列。

（2）18SrDNA序列分析。序列同源性用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具進(jìn)行比較，并利用DNAS－tar軟件繪制進(jìn)化樹(shù)。

2.3.3 菌株的誘變處理，提高菌株產(chǎn)酶活力

（1）紫外誘變。取1mL106個(gè)/mL的孢子懸浮液于平皿中，采用20W紫外燈，照射距離為30cm，時(shí)間分別為5、8、10、15min，取1 02、103、104倍稀釋液各0.1mL涂布平板，35℃暗室培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑選出挑選單菌落周?chē)苋εc單菌落直徑比值大的菌株挑至斜面上，確定初篩菌株后再通過(guò)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。

（2）化學(xué)誘變。取1mL 106個(gè)/mL的孢子懸浮液于平皿中，加入一定濃度的亞硝酸鈉1mL，28℃水浴反應(yīng)5min，加2mL pH值為4.5的醋酸緩沖液，分 別 反 應(yīng) 5、8、10、20min，加 濃 度 0.7mol/L Na2HPO42mL終止反應(yīng)，按一定比例稀釋?zhuān)?.1mL涂布平板，35℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，酶活鑒定同紫外誘變。

（3）復(fù)合誘變。紫外誘變后，挑選的菌株進(jìn)行NaNO2誘變。NaNO2誘變后，挑選的菌株進(jìn)行紫外誘變。

（4）驗(yàn)證有無(wú)組成型突變菌株。制備菌懸液或孢子懸浮液，稀釋涂平板，在菌落上滴加0.1%稀碘液顯色1～2min，觀菌周?chē)欠裼械矸鬯馊Α?/p>

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離

不做任何處理的土壤稀釋液涂平板，分離得到3株產(chǎn)酶活力較大的細(xì)菌菌株，水解圈直徑與菌落直徑比值分別為2.650、2.867、3.324；拌入50g可溶性淀粉土壤稀釋液涂平板，分離得到兩株產(chǎn)酶活力較大的細(xì)菌菌株，水解圈直徑與菌落直徑比值分別為2.983、4.053；拌入50g可溶性淀粉、10g蛋白胨稀釋液涂平板，分離得到3株產(chǎn)酶活力較大的細(xì)菌菌株和2株產(chǎn)酶活力較大的真菌菌株，水解圈直徑與菌落直徑比值分別為5.025、3.895、4.243、4.356、3.112；拌入50g可溶性淀粉、10g硫酸銨土壤稀釋液涂平板，分離得到4株產(chǎn)酶活力較大的細(xì)菌菌株，水解圈直徑與菌落直徑比值分別為4.449、4.500、4.356、4.264；拌入50g可溶性淀粉、10g硝酸鉀土壤稀釋液涂平板，分離得到3株產(chǎn)酶活力較大的細(xì)菌菌株，水解圈直徑與菌落直徑比值分別為4.250、5.011、4.800。對(duì)分離得到菌株依次編號(hào)為：ba－1、ba－2、ba－3、ba－4、ba－5、ba－6、ba－7、ba－8、fu－1、fu－2、ba－9、ba－10、ba－11、ba－12、ba－13、ba－14、ba－15，菌株ba－6平板培養(yǎng)，水解圈直徑與菌落直徑比值最大，為5.025。分離得到17個(gè)菌株中，15個(gè)細(xì)菌菌株，2個(gè)霉菌菌株，未見(jiàn)放線菌菌株，與土壤中微生物數(shù)目培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件有關(guān)，土壤中細(xì)菌數(shù)目最多，其次為霉菌孢子數(shù)，細(xì)菌形成菌落一般為1～2d，霉菌3～4d，放線菌6～7d。土壤用可溶性淀粉富集培養(yǎng)后，篩選得到的產(chǎn)淀粉酶菌株產(chǎn)酶活力高，說(shuō)明富集培養(yǎng)有利于高產(chǎn)菌株篩選。細(xì)菌菌株平板培養(yǎng)，以ba－5酶活力最高，水解圈直徑與菌落直徑比值為5.025，ba－1產(chǎn)酶活力最低為2.650，真菌中fu－1酶活力最高為4.356。

從液體培養(yǎng)基復(fù)篩測(cè)定淀粉酶活力的結(jié)果可以看出，菌株平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)產(chǎn)酶活力不一致，微生物平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)，菌體的生長(zhǎng)擴(kuò)散速度及養(yǎng)分和氧氣的供應(yīng)等都有差異，造成產(chǎn)酶能力變化不一致，以1mL濾液5min內(nèi)水解淀粉生成1μmol還原糖量定義為1個(gè)活力單位（U），液體培養(yǎng)，菌株ba－3濾液酶活力最低，為14.8U/mL。菌株fu－1濾液酶活力最高，為36.9U/mL，選擇菌株fu－1為出發(fā)菌株。

3.2 菌株鑒定

3.2.1 菌株fu－1形態(tài)特征

菌落初為白色，后變成黑色厚絨狀。分生孢子梗頂部形成球形頂囊，頂囊球形，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長(zhǎng)有成串褐黑色的球狀分生孢子，分生孢子褐色球形。有時(shí)在新分離的菌株中能找到白色、圓形、直徑約1mm的菌核（圖1、圖2）。

圖1 菌株菌絲體形態(tài)

圖2 菌株頂囊、分生孢子形態(tài)

3.2.2 菌株fu－1鑒定

（1）18SrDNA序列分析?；蚪M提取及PCR擴(kuò)增，提取分離菌株fu1的基因組，用真核生物通用引物SPF1、SPR1擴(kuò)增基因組DNA，結(jié)果顯示：分離菌株fu1 18SrDNA PCR產(chǎn)物大小約為1 700bp。

（2）18SrDNA基因序列，獲得分離菌株的18S rDNA的PCR產(chǎn)物后，交于南京金斯特生物科技有限公司測(cè)序。

（3）分離菌株fu－1SrDNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，獲得fu－1SrDNA基因序列后，提交NCBI進(jìn)行BLAST分析，NCBI登錄號(hào)為lcl｜15007，同時(shí)用DNAStar軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），比對(duì)結(jié)果顯示fu1SrDNA基因序列與Aspergillus niger strain Ym33182相似性達(dá)到99%，結(jié)合形態(tài)特征，可以認(rèn)為分離菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）。將分離分離菌株fu－1命名為黑曲霉An。

圖3 分離菌株fu－1 18SrDNA基因序列與已知相關(guān)序列的聚類(lèi)進(jìn)化樹(shù)

3.3 誘變處理，提高菌株產(chǎn)酶活力

3.3.1 紫外線誘變

以黑曲霉菌株An為出發(fā)菌株，誘變處理5min，誘變后的菌株中共有7株水解圈/菌株直徑比值 大 于 4.356，分 別 為 4.563、4.782 、4.877、4.471、4.688、4.874、4.844，誘變處理8min，誘變后的菌株中共有4株水解圈/菌落直徑比值大于4.356，分別為5.174、4.812、4.381、4.688，誘變處理10min，誘變后的菌株中共有2株水解圈/菌落直徑比值大于4.356，分別為4.542、4.733，誘變處理15min，誘變后的菌株中僅有1株水解圈/菌落直徑比值大于4.356，為4.755，上述菌株依次編號(hào)為An－1u至An－14u。紫外線誘變結(jié)果顯示，絕大多數(shù)突變?yōu)樨?fù)變，僅得到14個(gè)水解圈/菌落直徑比值大于原菌株的突變株，誘變處理5min效果較好，正變菌株數(shù)目最多，有7株，誘變處理8min，水解圈/菌落直徑比值5.174的菌株為正變幅度最大的菌株。

原始菌株為36.9U/mL，誘變所分的菌株An－1u至An－14u液體培養(yǎng)產(chǎn)酶活力分別為；39.1、30.5、26.1、32.1、45.6、45.4 、41.0 、51.2 、31.5 、45.2、31.6、26.8、35.3、38.2U/mL，僅有7個(gè)菌株液體培養(yǎng)的濾液酶活力大于原始菌株，與水解圈/菌落直徑比值的結(jié)果不一致，是由于液體、固體培養(yǎng)條件不一致。液體培養(yǎng)產(chǎn)酶活力最大的菌株為An－8u，其濾液酶活力為51.2U/mL。

3.3.2 NaNO2誘變

以黑曲霉菌株An為出發(fā)菌株，分別用0.02、0.05、0.1mol/lHNO2處理孢子懸浮液5min、8min、10min、20min。

0.02mol/L NaNO2處理孢子懸浮液5min、分離到水解圈/菌落直徑比值分別為5.467、4.706、5.538、5.810、5.440的菌株；處理8min，分離到水解圈/菌落直徑比值分別為5.086、5.273的菌株；處理10min，分離到水解圈/菌落直徑比值分別為6.325、4.043的菌株；處理20min，分離到水解圈/菌落直徑比值為4.543的菌株；共計(jì)10個(gè)菌株，依次編號(hào)為An－1c至An－10c。

0.05mol/L HNO2處理孢子懸浮液5min，分離到水解圈/菌落直徑比值分別為 4.808、4.719、4.888的菌株；處理8min，未分離到水解圈/菌落直徑比值大的菌株，可能是分離的平板數(shù)目不足夠多的原因；處理10min，分離到水解圈/菌落直徑比值分別為4.727、5.168、4.741的菌株，處理20min，分離到水解圈/菌落直徑比值為4.855的菌株，共計(jì)7個(gè)菌株，依次編號(hào)為An－11c至An－17c。

0.1mol/l NaNO2處理孢子懸浮液，僅在處理8min的孢子懸浮液中，分離到水解圈/菌落直徑比值分別為4.717、4.509的菌株依次編號(hào)為 An－18c、An－19c。

以上結(jié)果顯示低濃度NaNO2處理、且處理時(shí)間短，平板分離的正突變株數(shù)目多，高濃度NaNO2處理或處理時(shí)間長(zhǎng)，平板分離的正突變株數(shù)目少，可能因高濃度處理或長(zhǎng)時(shí)間處理造成孢子死亡率增加有關(guān)。

菌株An－1c至An－19c液體培養(yǎng)，濾液酶活力分別為52.1、39.9、26.3、33.6、42.0、35.8、57.6、38.9、33.4、34.6、41.2、43.7、43.2 、43.9、40.9、45.0、50.7、48.2、42.0U/mL，出發(fā)菌株黑曲霉菌An液體培養(yǎng)，酶活力為36.9U/mL，19個(gè)突變株中有14個(gè)菌株為正突變。突變株An－7c突變率最大，其濾液酶活力為57.6U/mL。

3.3.3 復(fù)合誘變

誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，NaNO2誘變后采用紫外誘變，紫外誘變后采用NaNO2誘變。

以菌株 An－8u為出發(fā)菌株，0.02mol/lNaNO2處理孢子懸浮液，處理5min，分離得到水解圈與菌落直 徑 比 值 分 別 為 5.261、5.727 突 變 株，處 理8min，分離得到水解圈與菌落直徑比值分別為5.307突變株，處理10min，分離得到水解圈與菌落直徑比值分別為5.531、6.242突變株，依次編號(hào)為An－8u－1c、An－8u－2c、An－8u－3c、An－8u－4c、An－8u－5c。

以菌株An－7c為出發(fā)菌株，紫外誘變處理5min，分離得到水解圈與菌落直徑比值分別為5.456、6.313、5.767突變株，紫外誘變處理8min，分離得到水解圈與菌落直徑比值為5.403突變株，紫外誘變處理8min，分離得到水解圈與菌落直徑比值為5.984突變株，依次編號(hào)為An－7c－1u、An－7c－2u、An－7c－3u、An－7c－4u、An－7c－5u。

驗(yàn)證有無(wú)組成型突變菌株培養(yǎng)基配方：胰化蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH7.0。制備An－8u－1c、An－8u－2c、An－8u－3c、An－8u－4c、An－8u－5c、An－7c－1u、An－7c－2u、An－7c－3u、An－7c－4u、An－7c－5u孢子懸浮液，涂布到驗(yàn)證有無(wú)組成型突變菌株培養(yǎng)基的平板上，在菌落上滴加0.1%稀碘液顯色1－2min，菌落周?chē)鷽](méi)有水解圈，說(shuō)明分離到上述突變菌株中沒(méi)有組成型突變，葡萄糖抑制了淀粉對(duì)淀粉酶的誘導(dǎo)作用，因而菌落周?chē)鷽](méi)有水解圈。

An－8u－1c、An－8u－2c、An－8u－3c、An－8u－4c、An－8u－5c、An－7c－1u、An－7c－2u、An－7c－3u、An－7c－4u、An－7c－5u液體培養(yǎng)，濾液酶活力分別為61.0、73.6、72.3、76.1、81.8、77.2、93.4、80.6、89.3、77.6U/mL，菌株 An－7c－2u濾液酶活力最高，確定為目的菌株。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選分離17個(gè)菌株，以液體產(chǎn)酶活力最高的菌株fu1，作為出發(fā)菌株。通過(guò)18S rDNA PCR擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，鑒定該菌株為黑曲霉。通過(guò)紫外誘變、化學(xué)誘變及復(fù)合誘變的方法，最終篩選到具有更高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株An－7c－2，其酶活提高到了出發(fā)菌株的253.11%。

前人對(duì)產(chǎn)淀粉菌株分離篩選及如何提高其產(chǎn)酶能力已經(jīng)有一定的研究：趙銘欽等對(duì)α－淀粉酶和菌株的誘變，其α－淀粉酶為出發(fā)菌株的1.964倍[4]；陳遠(yuǎn)釗等以從醋醅中篩選出產(chǎn)α－淀粉酶的酵母菌為出發(fā)菌進(jìn)行N＋離子注入誘變，使產(chǎn)物酶活提高了219%[5]；余詩(shī)慶等以一株產(chǎn)耐高溫α－淀粉酶菌株（地衣芽孢桿菌）為出發(fā)菌株，原生質(zhì)體制備后經(jīng)NTG（亞硝基胍）藥物誘變，最終篩選到具有高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株[6]。從這些研究中我們可以看到，高產(chǎn)淀粉酶分離篩選主要取決于兩方面：篩選地的選擇、誘變方法。篩選地的選擇因人而已，燕衛(wèi)東從貧瘠土壤中篩選淀粉酶生產(chǎn)菌株[7]，陳遠(yuǎn)釗等以從醋醅中篩選產(chǎn)α－淀粉酶的酵母菌[5]，王曉紅等從海洋沉積樣品及魚(yú)腸道中篩選出產(chǎn)淀粉酶的酵母菌菌株[8]；目前常用的誘導(dǎo)方法有物理誘變、化學(xué)誘變及復(fù)合誘變，陳遠(yuǎn)釗等以N＋離子注入誘變從醋醅中篩選出的產(chǎn)α－淀粉酶酵母菌[5]，郭宏文等進(jìn)行了紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理。篩選得到1株高產(chǎn)異淀粉酶的菌株[9]。由于篩選地選擇的隨機(jī)性以及基因突變的不確定性，因此能夠投入工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及選育需要較大的精力、物力投入。

由于時(shí)間關(guān)系，本研究未對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，未來(lái)需要通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)pH值、碳源、氮源等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，已期獲得適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的最佳發(fā)酵條件。

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Isolation and Identification of Bacterial Strains Yielding Amylase in Soil and Improvement of Yielding Amylase Ability