冷庫中低溫細菌的分離及鑒定

鄒昊

（麗水職業(yè)技術學院 環(huán)境工程分院，浙江 麗水323000）

1 引言

嗜冷微生物，又稱嗜冷菌，是指一類最適生長溫度低于15℃，最高生長溫度低于20℃和最低生長溫度在0℃以下的細菌、真菌和藻類的微生物[1]。而部分雖然能在0℃下生長，但最適生長溫度為20～40℃的微生物，則只能稱耐冷微生物[2]，易從不穩(wěn)定的低溫環(huán)境中分離得到，如冷水或土壤中。按照Morita的定義可將冷適應微生物分成兩類，即嗜冷微生物（psychrophiles）和耐冷微生物（psychrotolerants，又稱適冷微生物－psychrotrophs）。嗜冷微生物是指最適生長溫度為15℃，最高生長溫度低于20℃的微生物。而耐冷微生物通常指不能在0℃生長，但能在3～5℃生長，其最適和最大生長溫度在20℃以上的微生物。為了簡單起見，從廣義上講，也常用冷適應微生物（cold－adapted microorganism）這個詞表示這兩個類群。

嗜冷微生物能在土壤、海洋、河流以及植物和冷血動物的體內等環(huán)境中找到。在自然環(huán)境中，沒有哪個基本的物質循環(huán)能與嗜冷微生物的代謝活動分開，它們對自然界的基本循環(huán)有重要貢獻，如碳、氮、硫、磷等元素的循環(huán)。已知的嗜冷固氮根瘤菌，能夠產(chǎn)生某些降解大分子（如蛋白質、碳水化合物）以及低分子量的環(huán)境污染物的胞外酶。這些嗜冷微生物不僅在有機碳的再循環(huán)，而且在處理非天然的和人造的化合物中，都起了巨大的作用，是保持全球生態(tài)平衡必不可少的角色[3]。

生物圈大部分（約80%以上）溫度在20℃以下，而低溫微生物是指最適生長溫度小于20℃的微生物，因此，分離鑒定能分解蛋白質、淀粉、纖維素等物質的低溫細菌，不僅可對微生物多樣性進行研究，還將具有一定的實際應用價值[4]。

本文利用經(jīng)典微生物學方法，對職業(yè)技術學院肉制品保藏冷庫中的低溫微生物進行純培養(yǎng)分離和研究。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株來源

樣品采集自職業(yè)技術學院肉制品保藏冷庫。

2.1.2 培養(yǎng)基

實驗主要采用LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl l0，pH 值為7.0。LB固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂20，pH7.0。

2.1.3 酶和試劑

Ex－Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶和pMD18－T載體購自大連寶生物公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 方法

2.2.1 低溫細菌的分離

樣品的分離分別采用土壤懸液涂布法[5]（稱取少量土樣于滅菌三角瓶中，加入100倍于土樣質量的無菌水）、劃線法（用接種環(huán)挑取少許，在LB平板上劃線，置于150℃恒溫箱中培養(yǎng)）、點樣接種法（劃線平板上生長出單菌落后，用滅菌牙簽沾取少許菌樣，點接至母板Master Plate上，供進一步研究使用）。

2.2.2 低溫細菌的鑒定

（1）形態(tài)學觀察。結晶紫染色及革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

（2）生理生化鑒定。利用杭州天和微生物制劑有限公司的生化微量鑒定管進行生理生化鑒定。對5株分離細菌進行10種生理、生化鑒定。用砂輪割去鑒定管一端，加菌液15μL，管口塞少許已滅菌的棉花封口，防止雜菌參與反應，15℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察結果。將5株菌接種于LB平板上，置于不同溫度中培養(yǎng)，觀察菌體生長情況。

（3）16SrDNA序列分析。利用16SrDNA的一對通用引物進行PCR擴增，引物序列見表1。

表1 16SrDNA所用引物

PCR擴增反應體系（50L）組成如下：

10×Ex－Taq buffer 5L

2.5mM dNTP 3L

模板 10ng

正向引物f150pmol

反向引物r250pmol

Ex－Taq DNA polymerase 0.2L

無菌水 補足至50L

PCR擴增程序：94℃變性30sec，50℃退火1min，72℃延伸90sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR結束后，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pMD18－T載體（Takara產(chǎn)品）16℃連接10h。

連接體系如下：

膠回收產(chǎn)物 7.5L

pMD18－T載體 0.5L

10×T4DNA ligase buffer 1L

T4DNA ligase 1L

連接產(chǎn)物通過化學轉化法轉化E.coli DH5，涂布含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板，置于37℃培養(yǎng)12h。

以M13（RV/M4）為引物，通過菌落PCR擴增檢測轉化產(chǎn)物。引物序列如下：

M13（RV）：5′－ ATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC－3′，

M13 （M4）： 5′ － GTTTTCCCAGTCACGACGTTCTAAA－3′。

PCR結束后，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。PCR擴增驗證的產(chǎn)物進行雙向測序，然后將所測序列提交GenBank，通過Blastn進行序列同源性檢索分析。

3 結果分析

3.1 低溫細菌的分離

在低溫環(huán)境中共分離到低溫細菌5株。

3.2 低溫細菌的鑒定

分離到的5株菌均為革蘭氏陰性菌。

生理生化鑒定結果見表2。從表2可以看出，5株菌均無法利用衛(wèi)茅醇、山梨醇和乳糖為唯一碳源；5株菌均不能分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫；均可產(chǎn)生鳥氨酸脫羧酶及賴氨酸脫羧酶；01菌可利用硝酸鹽并產(chǎn)生氣體氨和氮氣，其它菌種不能。

將5株菌接種于LB平板上，置于不同溫度中培養(yǎng)，菌體生長情況見表3。

表2 細菌生理生化反應結果

表3 生長溫度測定結果

實驗結果表明，除01號菌外，其余菌在4～28℃下隨溫度的升高而生長速度加快。5株菌在37℃下均不能生長，這一特點符合低溫微生物的特征，且與采樣的低溫環(huán)境相符合。

01、02和03菌株的16SrDNA的擴增結果見圖1。

圖1 分離菌株16SrDNA電泳

分離菌株經(jīng)16SrDNA擴增后的序列，連接pMD18－T載體，測序拼接后的序列提交NCBI，通過Blastn比對進行分離菌株的初步鑒定。用DNAStar軟件構建系統(tǒng)進化樹[6]，如圖2所示。

從系統(tǒng)進化樹可看出，分離菌株與Pseudomonas屬中的各菌株歸于同一簇群。因此，依據(jù)形態(tài)學和生理生化試驗的結果，將其鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）的菌株。

圖2 分離菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

從環(huán)境中分離獲得5株低溫細菌，并對其中的3株低溫細菌的16SrDNA進行了測序，測序結果表明3株均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌株。

假單胞菌是微生物的重要類群，其廣泛分布于自然界之中，是自然界分布最廣的微生物之一。假單胞菌較廣的分布使其面對多樣的生境，多樣的生境造就了假單胞菌較廣的生長溫度、pH值，較多的營養(yǎng)代謝類型等，為人類提供了多樣的遺傳資源，使假單胞菌在環(huán)境的生物修復、生物防治、生物轉化等領域發(fā)揮了越來越重要的作用[7～9]。低溫有助于蛋白質的正確折疊[10]，假單胞菌有相當一部分屬于耐冷菌，用其作為宿主可生產(chǎn)一些用E.coli等中溫菌宿主無法生產(chǎn)或生產(chǎn)不好的蛋白質。同時，假單胞菌的營養(yǎng)類型多樣，利用其多樣的代謝途徑可以為人類生產(chǎn)某些用別的菌無法生產(chǎn)的物質。假單胞菌分布極廣，其遺傳多樣性異常豐富。這一特性決定了其有為人類解決諸多問題的巨大潛力。

[1]黃秀梨.微生物學（第二版）[M].北京：高等教育出版社，2003.

[2]沈 萍.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2000.

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[5]趙 斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002.

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