小鼠外周組織時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析

林慶玲，蔡彥寧，袁艷鵬，左曉虹

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物室，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

迄今哺乳動(dòng)物多個(gè)時(shí)鐘基因得到了鑒定，包括BMAL1、BMAL2、CLOCK、NPAS2、PER1、PER2、CRY1、CRY2及REV-ERBα等。時(shí)鐘基因?qū)τ谏锕?jié)律的產(chǎn)生和維持發(fā)揮重要作用［1］。哺乳動(dòng)物時(shí)鐘基因的節(jié)律表達(dá)不僅存在于視交叉上核，還存在于外周組織中如心、肝、腎、脾等［2-3］。PER1/PER2，CRY1/CRY2，CLOCK/NPAS2是旁系同源對(duì)。同時(shí)敲除旁系同源的兩個(gè)基因引起小鼠的晝夜節(jié)律喪失［4］。時(shí)鐘基因表觀遺傳調(diào)控在外周組織、癌細(xì)胞、腫瘤樣品以及圍產(chǎn)期發(fā)育中都有所研究［5-8］，這些研究表明，DNA甲基化可能調(diào)控正常機(jī)體發(fā)育和腫瘤發(fā)生中時(shí)鐘基因的表達(dá)。此外，時(shí)鐘基因甲基化狀態(tài)與路易體癡呆和老化有關(guān)［9-10］。

甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)是一種鑒定啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的簡單快速的方法［11］。而今未有關(guān)于小鼠時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的報(bào)道，而小鼠是研究人類發(fā)育和老化必不可少的模型，所以應(yīng)用MSP方法對(duì)小鼠時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化檢測(cè)非常有意義。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩套MSP鑒定小鼠時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，檢測(cè)了小鼠5個(gè)外周組織 8 個(gè)時(shí)鐘基因 PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1和BMAL2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

QIAamp DNA mini kit(Qiagen，CA公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司);HS Taq(Takara公司);GelRed(Biotium，CA公司);SssI(CpG甲基化酶New England Biolab公司);引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠5只，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)-2007-004。按如下條件飼養(yǎng)2 周:飲食、飲水自由，08∶00開燈，20∶00關(guān)燈，照明:黑暗時(shí)間為12 h∶12 h。動(dòng)物處理按照美國國立衛(wèi)生研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方針和首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用委員會(huì)指導(dǎo)方針。5只小鼠在09∶00處死，分別獲得肝臟、心臟、腎臟、胸腺和睪丸組織。

1.3 基因組DNA提取和亞硫酸氫鹽處理

基因組DNA的提取按照QIAamp DNA mini kit說明書進(jìn)行。偏重亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚對(duì)基因組DNA進(jìn)行修飾，將未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，而甲基化的C保持不變。基因組DNA最初的變性應(yīng)用0.3 mol/L的NaOH。偏重亞硫酸氫鈉與對(duì)苯二酚的混合溶液(pH 5.0)與基因組DNA混合50℃孵育16 h。變性DNA的提取按照Wizard DNA purification resin說明書進(jìn)行。加入0.3 mol/L NaOH在37℃孵育15 min結(jié)束反應(yīng)，乙醇沉淀獲得DNA。

1.4 啟動(dòng)子分析和引物設(shè)計(jì)

時(shí)鐘基因啟動(dòng)子分析應(yīng)用在線軟件(http://www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)［12］。同一軟件設(shè)計(jì)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)MSP引物，引物見表1和表2。應(yīng)用在線軟件(http://www.urogene.org/methprimer)分析時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下游各600 bp長度序列。

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)

偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA應(yīng)用HS Taq(Takara，Japan)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳，GelRed(Biotium公司)染色。為了確定MSP特異性，SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對(duì)照，未經(jīng)偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為陰性對(duì)照。

1.6 MSP產(chǎn)物序列

PCR產(chǎn)物經(jīng)北京華大基因研究中心測(cè)序。

2 結(jié)果

第一套引物檢測(cè)的8個(gè)時(shí)鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)啟動(dòng)子區(qū)均為非甲基化狀態(tài)(圖1)。

第二套引物檢測(cè)的8個(gè)時(shí)鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)啟動(dòng)子區(qū)均為非甲基化狀態(tài)(圖2)。擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京華大基因研究中心測(cè)序得到進(jìn)一步證實(shí)(圖3，4)。

表1 時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析第一套引物Table 1 The first set of primers used for methylation analysis in the promoter of eight clock genes

表2 時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析第二套引物Table 2 The second set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

續(xù)表1

圖1 8個(gè)時(shí)鐘基因在肝、心、腎、胸腺、睪丸中第一套引物PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using set I primers

圖2 8個(gè)時(shí)鐘基因在肝、心、腎、胸腺、睪丸中第二套引物PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using setⅡ primers

3 討論

CpG島存在于啟動(dòng)子區(qū)。MSP引物設(shè)計(jì)用于檢測(cè)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的CpG位點(diǎn)。因?yàn)榧谆禺愋訮CR只能檢測(cè)約3～4個(gè)CpG位點(diǎn)，因此容易出現(xiàn)假陰性MSP。為避免這個(gè)問題，除了PER1之外每個(gè)基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，用于擴(kuò)增同一啟動(dòng)子區(qū)不同的位點(diǎn)。

甲基化特異性PCR(MSP)是一種簡單快速和經(jīng)濟(jì)的檢查檢測(cè)CpG島甲基化狀態(tài)的方法。對(duì)于每個(gè)MSP檢測(cè)，兩對(duì)引物中一對(duì)針對(duì)甲基化的DNA(M)，另一對(duì)針對(duì)非甲基化的DNA(U)。以前的研究表明，肝臟基因組DNA時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)為非甲基化狀態(tài)［5，13］。因此，偏重亞硫酸氫鹽處理的肝臟基因組DNA用于優(yōu)化U引物對(duì)。肝臟基因組DNA依次經(jīng)Sss I和偏重亞硫酸氫鹽修飾處理用于優(yōu)化M引物對(duì)。正確大小的特定的擴(kuò)增子得到了擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，鑒定了擴(kuò)增產(chǎn)物和甲基化狀態(tài)。

結(jié)果表明，所有的CpG位點(diǎn)均為非甲基化狀態(tài)。作為陽性對(duì)照的SssI處理的基因組DNA均能得到擴(kuò)增。該結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致，表明成年鼠時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)為非甲基化狀態(tài)。有趣的是，一項(xiàng)先前的研究證明，PER1啟動(dòng)子區(qū)存在一些顯著的甲基化。而該研究MSP方法鑒定了先前研究的不同的位點(diǎn)。確實(shí)，甲基化CpG位點(diǎn)在CpG島外并在第3和第4 E-box周圍［13］。

本研究鑒定了小鼠8個(gè)時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。檢測(cè)的小鼠外周組織肝、心、腎、胸腺、睪丸中時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)均為非甲基化狀態(tài)。本研究與先前的研究都表明，在成年小鼠外周組織中，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)均為非甲基化狀態(tài)。

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